Рак молочной железы (РМЖ) является заболеванием с эпидемической распространенностью, определяющим вторую по частоте после сердечно-сосудистых заболеваний смертность в женской популяции. Доля наследственного РМЖ, обусловленного наличием герминальных (зародышевых) мутаций, составляет 5–15% [1], тогда как в подавляющем большинстве случаев заболевание возникает по причине приобретенных изменений генетического аппарата клетки. Речь идет не только о спорадических мутациях, возникающих в течение жизни. Огромное значение имеют эпигенетические, то есть не затрагивающие последовательность нуклеотидов в ДНК изменения, механизмы регуляции экспрессии генов.

Причиной запуска онкогенеза может быть как повышение активности генов, ответственных за инициацию опухолевого роста в стволовых клетках или клетках-предшественниках [2], так и подавление всех регулируемых этапов функционирования генов-супрессоров. Дефекты генов-супрессоров, как факторов прогрессии опухолевого роста, рассматриваются в качестве ведущих причин онкопатологии [3].

Воздействие эндогенных эстрогенов ассоциируется с РМЖ у женщин в пре- и постменопаузе [4], причем до 70% всех случаев РМЖ приходится на долю эстроген-рецептор-позитивных (ER+) и прогестерон-рецептор-позитивных (PR+) форм [5]. Однако риск заболевания значимо возрастает в возрасте угасания функции яичников и абсолютного, в сравнении с репродуктивным возрастом, дефицита циркулирующих эстрогенов. Изучение механизмов запуска эстрогенами проонкогенов, причин развития дефектов генов-супрессоров, является одной из самых актуальных задач современной биологии и медицины, поскольку невозможно предположить, что главный атрибут женственности призван активировать карциноидную программу.

Основным органом биотрансформации эстрогенов является печень, но этот процесс осуществляется и в периферических тканях, в частности, в молочной железе (МЖ). Метаболизм эстрогенов включает 2 основных этапа – гидроксилирование и метилирование.

Процесс гидроксилирования – присоединения ОН-группы к углеродным атомам в различных положениях молекулы эстрогена – приводит к образованию гидроксиэстрогенов – 2-ОН-эстрадиола (2-ОН-Е2), 4-ОН-Е2, 2-ОН-эстрона (2-ОН-Е1), 4-ОН-Е1, именуемых катехолэстрогенами. Название катехолэстрогенов происходит от сходства структуры их А-кольца с диокси-бензольным кольцом катехоламинов. Также в процессе гидроксилирования образуются 16α-ОН-эстрогены. Катехолэстрогены вступают в следующий этап метаболизма – метилирование. При этом 16α-ОН-эстрогены не метилируются, быстро превращаясь в конечный продукт эстриол (Е3) [6, 7].

Главным предназначением метилирования является полная инактивация эстрогенов. Метилированные катехолэстрогены (метокси-эстрогены), а также эстриол, вступают в реакцию конъюгирования с сульфатами или глюкуроновой кислотой. Конъюгация считается реакцией детоксикации, посредством которой гормоны либо становятся водорастворимыми, выделяясь затем с мочой или фекалиями, либо превращаются в более липофильный фрагмент с повышенным периодом полураспада [6].

Ключевая роль в метаболизме эстрогенов принадлежит ферментам семейства P450 (CYP), кодируемым соответствующими генами; 2-гидроксилирование катализируется, главным образом, изоформами CYP1A2 и CYP3A4 в печени и CYP1A1 во внепеченочных тканях [7]. CYP1B1 является ключевым ферментом образования 4-ОН-эстрогенов, но в процессе их синтеза могут участвовать цитохромы 1А2 и 2В1/2 [7]. Ген CYP1B1 имеет приблизительно 40% гомологическое сходство и некоторую перекрывающуюся метаболическую активность с CYP1A1 и CYP1A2. Однако в отличие от них CYP1B1 экспрессируется не в печени, а во многих внепеченочных тканях, включая МЖ [8] (рис. 1).

Рис. 1. Схема синтеза и метаболизма эстрогенов с образованием ДНК-аддуктов (адаптировано из Cavalieri EL, et al. [9]).

Образование 16α-ОН-эстрогенов контролируется CYP3A4.

Количественно 2-гидроксилирование является основным метаболическим путем по сравнению с реакциями 4- и 16-гидроксилирования. 2-гидроксиэстрогены обладают низкой аффинностью к ER и демонстрируют пониженную гормональную активность, по сравнению с эстрадиолом. Это позволяет исследователям относить их к «антиэстрогенам», поскольку они препятствуют избыточной пролиферации и потенцируют апоптоз [7].

Для 4-ОН-производных характерна низкая скорость выведения из организма, что способствует более продолжительному их воздействию на эстроген-зависимые ткани и теоретически может приводить к усиленной активации ER.

16α-ОН-Е1, несмотря на мощный агонизм к ER и высокую митогенность, относится к слабым канцерогенам, так как превращается в эстриол [7].

Важнейшим шагом в понимании патогенеза РМЖ явилась теория «переключения» эстрогенного эффекта с гормонального на генотоксический, согласно которой главными виновниками развития опухоли признаны не собственно метаболиты эстрогенов, какими бы активными они не были, а их производные, лишенные признаков гормонов, но способные изменять структуру и свойства ДНК, т.е. подходящие под определение химических канцерогенов [9].

Концепция генотоксичности состоит в том, что специфические критические мутации генерируют аномальную пролиферацию клеток, приводящую к раку, но не связанную с запуском эффектов эстрогенов через рецептор. Специфичность этих мутаций определяется образованием интеркалированного комплекса неметаболизированных эстрогенов с ДНК (встраивание между основаниями ДНК) перед конверсией в ковалентную связь [9]. Канцерогенность производных эндогенных эстрогенов распространяется не только на их органы-мишени, но и не зависимые от эстрогенов ткани [10]. Таким образом, естественный процесс эстроген-опосредованной пролиферации ради развития, дифференцировки клеток, репаративного или регенеративного обновления, после запуска канцерогенеза представляется средством поддержания патологических митозов.

Происхождение упомянутых проканцерогенов и формирование генотоксичности эстрогенов кроется в нарушении инактивации 2- и 4-ОН-эстрогенов (катехолэстрогенов) в реакциях метилирования.

Метилирование веществ до их метоксипроизводных (перенос метильных групп -СН3) происходит не только с белками, полисахаридами, фосфолипидами, но и с ДНК и РНК. Этот процесс является главным в дезактивации не только гормонов, но и различных соединений, предназначенных для выведения из организма. Метилирование осуществляют различные ферменты – метилазы (метилтрансферазы). Классическим донатором подвижных метильных групп является незаменимая аминокислота метионин.

Метилирование катехолэстрогенов осуществляется при участии фермента катехол-О-метилтрансферазы (КОМТ), синтез и активность которого кодируются геном COMT, расположенным на хромосоме 22q11. S. Dawling и соавт. [11] изучали возможности генов CYP1A1 и CYP1B1, контролирующих синтез 2-, 4-гидроксилаз и, как следствие, образование 2-ОН и 4-ОН-эстрогенов, вызывать O-деметилирование метоксиэстрогенов, т.е. повторный синтез гидроксиэстрогенов. Оказалось, что метоксиметаболиты ингибируют CYP1A1- и CYP1B1-окисление, не позволяя реактивировать гидроксиметаболиты. Более того, сами метоксиметаболиты оказывают дозозависимый антипролиферативный эффект.

Обязательным условием полноценного метилирования катехолэстрогенов является доступность метильных групп, состоятельность гена СОМТ, а также участие антиоксидантов. При дефиците фермента КОМТ и антиоксидантов [7] катехолэстрогены вовлекаются в образование семихинонов и хинонов. Хиноны опасны своей способностью изменять структуру ДНК, за счет образования так называемых ДНК-аддуктов, что блокирует процесс транскрипции.

Дериваты 2-катехолэстрогенов (2,3-хиноны) считаются безопасными в отношении канцерогенеза. Они образуют с ДНК стабильные аддукты, сохраняющиеся в молекуле ДНК до полного завершения процесса репарации. Производные 4-катехолэстрогенов (3,4-хиноны) более реактивны и легче взаимодействуют с нуклеофильными группами ДНК. Потеря эстроген-3,4-хиноном протона, быстрое разрушение гликозидной связи в молекуле нуклеотида ДНК и формирование между ними обратимого изомера (реакция сопряженного присоединения Михаэля) – такова модель образования аддукта [9, 12]. 3,4-хиноны высвобождаются от связи с ДНК, оставляя после себя нерепарируемые участки, закрепляя повреждение в последующих поколениях клеток [7] (см. рис. 1).

Известные антиоксиданты, такие как глутатион, N-ацетилцистеин, а также ресвератрол (присутствует в винограде), не только ингибируют образование эстроген-ДНК-аддуктов, но и восстанавливают хиноны и семихиноны до 4-OH-Е2 и даже модулируют экспрессию CYP1B1, если он сверхактивен [9].

Элиминация эстроген-3,4-хинонов возможна путем конъюгации с глутатионом или путем восстановления катехолэстрогенов с помощью хинонредуктазы (NQO1 и NQO2). Чрезмерное образование депуринирующих аддуктов является результатом грубого нарушения баланса между активирующим и дезактивирующим путями метаболизма эстрогена. Гиперактивация фермента ароматазы (CYP19), приводящая к синтезу эстрогенов in situ, сверхэкспрессия сульфатазы, переводящей неактивные сульфатные формы эстрогенов в Е2 и Е1, нерегулируемая активность CYP1B1 и синтез, прежде всего, 4-OH-производных, низкие концентрации глутатиона при дефиците хинонредуктаз – все это элементы сценария упорного производства хинонов.

В настоящее время профилактика РМЖ основана на маммографическом скрининге, а системный подход в терапии данного заболевания предусматривает иммуногистохимическое определение четырех подтипов РМЖ (люминальный А и В (ER+/PR+), HER2-экспрессирующий и трижды негативный. В настоящей работе анализируется лишь последний этап метаболизма эстрогенов – метилирование, и влияние на него некоторых аспектов образа жизни, т.е. рассматривается профилактика РМЖ через возможное вмешательство в механизмы полной инактивации эстрогенов.

Метилирование полифункционально. Оно охватывает не только нейтрализацию ряда веществ, но и модификацию генов, а значит – их способность к экспрессии. С позиции прижизненных изменений эпигенома, на наш взгляд, небезынтересно рассматривать функциональность самого гена СОМТ, который, с одной стороны, модулирует общее метилирование в организме, а с другой, сам может активироваться или, наоборот, «заснуть» при перепрограммировании генома в условиях дефицита метильных групп. Связь между метилированием промотора СОМТ и когнитивными или психическими нарушениями широко исследуется в настоящее время, поскольку КОМТ контролирует дофаминергическую активность мозга. Подобный подход к изучению метаболизма эстрогенов, возможно, будет способствовать не только защите от онкогенеза, но и безопасности менопаузальной гормональной терапии (с точки зрения ее влияния на ER+ типы РМЖ).

При участии фермента метионинаденозилтрансферазы (МАТ) из метионина и аденозинтрифосфата (АТР) образуется макроэргическое коферментное производное S-аденозилметионин (SAM) [13]. SAM является донатором метила для 200 метилтрансферазных преобразований ДНК, РНК, белков и метаболитов, вовлечен в широкий диапазон метаболических и сигнальных путей. Метилтрансферазы (МТ) катализируют перенос метила на различные акцепторные молекулы (X). После отдачи метильной группы SAM превращается в S-аденозилгомоцистеин (SAH). Далее SAH подвергается гидролизу под действием SAH-гидролазы (SAHH) с образованием гомоцистеина и аденозина. Этот каскад ферментативных реакций, обозначаемый как трансметилирование, происходит практически в каждой клетке человеческого организма.

Гомоцистеин является промежуточным продуктом метаболизма метионина и должен превратиться в цистеин. Гомоцистеин токсичен, содержится в клетках организма в незначительных количествах и может метаболизироваться двумя путями: транссульфирования и реметилирования.

Транссульфирование осуществляется с участием фермента цистатионин-β-синтазы и витамина В6 в качестве кофактора, что обеспечивает элиминацию до 70% гомоцистеина [14].

Процесс реметилирования в свою очередь проходит по двум независимым друг от друга вариантам: 1) использование метильной группы от молекулы метаболита фолиевой кислоты (5-метилтетрагидрофолата – 5-MTHF), катализируемое метионинсинтазой (MS). При этом промежуточным переносчиком метильной группы выступает витамин В12 – метилкобаламин; 2) заимствование метильной группы от молекулы бетаина (активный метаболит поступающего с пищей витамина В4 – холина) при участии фермента бетаин-гомоцистеин-метилтрансферазы (BHMT). При отклонениях в системе фолатного цикла и недостатке витамина В12, восстановление метионина за счет бетаина становится основным [15] (рис. 2).

Рис. 2. Цикл фолиевой кислоты (адаптировано из S. Lu, et al. [13]).

Поступление фолата с пищей, восстановление фолата до дигидрофолата (DHF) и, далее, до тетрагидрофолата (THF); 2) образование из THF 5,10-метилентетрагидрофолата (5,10-MTHF), сопряженное с распадом серина или глицина; 3) восстановление 5,10-MTHF до 5-MTHF с последующей регенерацией метионина из гомоцистеина и одновременным превращением 5-MTHF в THF. Ген MTHFR кодирует синтез фермента метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), катализирующей восстановление 5,10-MTHF в 5-MTHF. Ген MTRR кодирует синтез фермента метионин-синтазы-редуктазы (MSR), катализирующей обратное превращение гомоцистеина в метионин. Метильная группа переносится на витамин В12, который затем отдает ее гомоцистеину, образуя метионин с помощью MS. Ген MTR кодирует цитоплазматический фермент MS. Однако в некоторых случаях В12 может окисляться, что приводит к подавлению MS. Для поддержания активности фермента необходимо восстановительное метилирование с помощью фермента MSR. В норме образование dTMP из dUMP сопряжено с превращением 5,10-MTHF в DHF; в этой реакции одна углеродная группа 5,10-MTHF переносится в молекулу dUMP, что приводит к образованию dTMP и DHF. dUMP является важнейшим соединением, необходимым для синтеза любой клеточной ДНК. DHF под влиянием DHF-редуктазы (DNFR) также восстанавливается до THF (адаптировано из M. Varela-Rey, et al. [32]).

Для процессов метилирования совершенно необходимо присутствие в тканях организма переносчиков -СН3-групп. Таковыми являются витамины группы В, в том числе фолиевая кислота (витамин В9). Пищевыми источниками метионина являются бразильский орех, яйца, мясо, молоко, рис, рыба; фолиевой кислоты и холина – зелень, цитрусовые, бобовые, пшеница; бетаина – рис, ячмень, сахарная свекла, бобовые, овес, картофель.

Акторами, определяющими статус общего метилирования в организме, являются абсолютный дефицит и сезонные колебания пищевых донаторов метила. Существенно нарушаются процессы метилирования при ожирении в связи с развитием стеатоза печени, нарушением адипокиновой регуляции активности КОМТ при одновременном повышении потребности в экспрессии СОМТ [16]. Интерес представляет изучение доступности метильных групп при употреблении сверхдопустимых количеств алкоголя, курении, хроническом стрессе, поскольку речь идет о модифицируемых пусковых факторах нарушения метаболизма эстрогенов.

Тотальное ДНК-гипометилирование

В настоящее время ключевыми механизмами канцерогенеза, в том числе в МЖ, признаны изменения не структуры, а активности генов протоонкогенов, генов-супрессоров. Основной эпигенетической модификацией генома человека является метилирование молекул ДНК клетки. Очевидно, что если термин «метилирование» употребляется по отношению к ДНК генома, то он не ассоциируется с детоксикацией в прямом смысле слова. Эпигенетические изменения могут передаваться по наследству, но, в отличие от генетической информации, воспроизводятся в 3–4 поколениях, исчезая при неустойчивом внешнем факторе [17].

Метилирование ДНК – это добавление метильной группы непосредственно к цитозиновому основанию в матрице ДНК с образованием 5-метилцитозина. Метилирование ДНК не изменяет первичной последовательности нуклеотидов, но необходимо для функционального подавления (сайленсинга) определенных генов. Реакции метилирования ДНК катализируются группой ферментов ДНК-метилтрансфераз (DNMT).

Энзиматическое метилирование остатков цитозина по пятому положению осуществляется в составе 5/-CpG динуклеотидов (CpG-сайтов). Около 60–70% всех CpG-динуклеотидов у млекопитающих метилированы. Неметилированные CpG-динуклеотиды сгруппированы в так называемые «CpG-островки», обнаруживаемые на промоторах большинства генов человека.

Долговременный сайленсинг гена может быть обеспечен метилированием района островков CpG. Цитозины CpG островков постоянно экспрессируемых генов неметилированы, тогда как CpG в регулируемых генах могут быть метилированными или неметилированными, что коррелирует с уровнем транскрипции гена [18]. Таким образом, метилирование ДНК является динамичным процессом, изменяющимся под влиянием факторов внутренней и внешней среды.

Глобальное гипометилирование ДНК, сопровождаемое повышением экспрессии ряда генов, является характерным признаком старения организма. Задачей гипометилирования ДНК является индукция клеточной трансформации, активация регенераторных процессов после воздействия каких-либо повреждающих факторов [18]. Однако гипометилирование ДНК вследствие дефицита СН3-групп может происходить в отдельных локусах или на протяженных участках хромосомы и запускать процесс развития опухолей. На уровне индивидуальных генов гипометилирование ДНК запускает многоэтапный неопластический процесс благодаря активации протоонкогенов, дерепрессии ранее метилированных генов, вызывающих аберрантные функции клеток [19]. Причины нарушения нормальных процессов метилирования требуют уточнения.

Важно, что как в нормальных стареющих клетках, так и в опухолевых культурах на фоне тотального гипометилирования обнаруживаются гиперметилированные CpG-островки в промоторных участках отдельных генов. Метилирование считается стабильной и наследуемой модификацией гена, хотя в его обратимости под воздействием деметилирующих агентов или ферментов заключается одно из принципиальных отличий данного процесса от мутаций в ДНК [18]. Если гиперметиляции подвергаются гены-супрессоры опухолей, снижается их экспрессия, а значит, становится очевидным риск канцерогенеза.

Четких объяснений неодинаковой чувствительности динуклеотидных островков к метилированию в настоящее время не получено. В эксперименте показано, что в клетках в условиях искусственно созданной избыточной экспрессии DNMT часть CpG-островков становятся гиперметилированными, а другие (большинство) – не метилируются вообще. Возможно, избирательная чувствительность к DNMT объясняется неодинаковой готовностью гена к экспрессии в клетках разной степени дифференцировки [18]. Пусковые механизмы локального гиперметилирования ДНК, приводящие к устойчивой инактивации гена, также не ясны. Повышение метилтрансферазной активности [20] может быть адаптационной мерой, формирующейся в условиях аномального (возможно, продолжительного) гипометилирования. Исходя из этой гипотезы, можно полагать, что раннее предупреждение гипометилирования проапоптотических генов, генов-супрессоров опухолей предотвращает их последующее компенсаторное гиперметилирование и может быть независимой мерой профилактики ряда заболеваний, в том числе РМЖ.

Остается неизвестным, является ли процесс гиперметилирования первопричиной, ответственной за сайленсинг целевых генов опухолевой супрессии. D. Sproul и соавт. [21] провели анализ CpG-островков промоторов генов опухолевой супрессии в различных типах рака. Оказалось, что гены, которые уже подвергнуты гиперметиляции, супрессированы не только в опухолевой, но и в здоровой ткани, причем задолго до развития неоплазии. Аберрантное гиперметилирование в большей мере отражает онтогенетическое развитие клетки и вовлеченность эпигенетических механизмов в поддержание активности тех или иных генов в здоровой клетке. В частности показано, что статус метилирования ДНК у новорожденных детей определяется воздействием в период внутриутробного развития на их организм табака [22] и высокожирного питания матери [23].

N. Bloushtain-Qimron и соавт. [24] нашли, что воздействие эстрогенов на еще незрелые, недифференцированные эпителиальные клетки МЖ сопряжено с увеличением риска РМЖ во взрослом состоянии. Несколько генов, вовлеченных в дифференцировку стволовой клетки, гипометилированы и имеют чрезвычайно высокий уровень экспрессии в прогениторной клетке, в сравнении с высокодифференцированной. Иными словами, еще на уровне стволовой клетки, обладающей способностью к самовоспроизводству, закладывается более ощутимая реакция на эстрогеновый стимул. Запечатление (импринтинг) эффектов эстрогенов объясняет участие в карциногенезе таких факторов, как срок менархе, завершенные беременности, время наступления постменопаузы. Обобщенное мнение исследователей таково, что риск РМЖ накапливается на протяжении всей жизни женщины, однако быстрое возрастание этого риска происходит после начала эстрогенизации [25].

Известно, что активность КОМТ в тканях человека неодинакова и изменяется с возрастом [26]. Модуляция метилирования ДНК гена COMT является одной из задач профилактики РМЖ.

Большое количество исследований было посвящено однонуклеотидному полиморфизму COMT Val158Met, который является наиболее изученным вариантом из-за его местоположения в кодирующей области экзона 4 [16]. Замещение метионина (Met) на валин (Val) в положении 158 приводит к трех-четырехкратному подавлению активности фермента КОМТ из-за снижения стабильности белка. В то же время эпигенетическая вариация, дифференцированное метилирование множественных локусов гена СОМТ ассоциируется с социально-экономическим статусом, стрессом, этнической принадлежностью, потреблением алкоголя и табака [26].

Таким образом, огромный интерес представляют исследования в области влияния факторов окружающей среды на активность синтеза КОМТ, как регулятора детоксикации. Гиперметилирование самого СОМТ вызовет его «молчание», то есть нарушение полноценного метаболизма многих молекул. Новое направление современной медицины предполагает детальный анализ всех метилированных последовательностей генома (метилом), поскольку ДНК-метилирование генов промитогенной и проапоптотической направленности прогностически важно для оценки индивидуального онкориска.

Питание и образ жизни, сопряженный с потреблением сверхдопустимых количеств алкоголя, курением, ожирением [16], определяют доступность метильных групп в организме и эпигенетические изменения ДНК генома. Абсолютный дефицит донаторов и переносчиков метила (метионина, холина, витамина В12 и фолиевой кислоты), а также возраст и другие факторы онтогенеза ассоциированы с фенотипическими геномными различиями [13].

Развивающаяся область исследований, называемая нутригеномикой, изучает влияние пищи на геном человека с целью профилактики ряда заболеваний. Недостаток или избыток источников -СН3 отражается на поступлении SAM в цикл метионина. Гипометиониновая (гипохолиновая) диета сопровождается снижением печеночного запаса SAM, а колебания уровней SAM, SAH и гомоцистеина определяют потенциал метилирования всех SAM-зависимых молекул [13]. Метильные группы необходимы для образования фосфатидилхолина в печени, обеспечивающего «сборку» ЛПОНП и выведение триглицеридов в кровоток [27]. Таким образом, дефицит SAM ответственен за нарушение синтеза ЛПОНП, сопровождается инфильтрацией печени триглицеридами и в конечном итоге ассоциируется с манифестацией или прогрессированием неалкогольной жировой болезни печени [16].

При развитии стеатоза печени ожидается подавление продукции SAM. Однако A. Elshorbagy и соавт. [28], напротив, отмечают усиление конверсии метионина в SAM, что, по всей видимости, определяется индивидуальными особенностями печеночного метаболизма. В условиях нарушенного поступления метионина, важным является присутствие бетаина, поскольку он предотвращает не только дефицит общего метилирования, но и гипометилирование ДНК [15].

Перенасыщение пищевыми источниками метила у трансгенных мышей также сопровождалось развитием жировой дистрофии печени. Чрезмерное употребление метионина коррелировало с уровнями SAM, SAH [28], с риском проявления генотоксичности. Однако схожее исследование с применением супрафизиологических концентраций метионина не подтвердило влияния гиперметионинемии на геномную стабильность и статус метилирования ДНК [29]. Вероятно, разумные (некритические) колебания поступления метионина с пищей могут быть «откорректированы» механизмами адаптации, реализуемыми до определенного предела.

Международное агентство по изучению рака (International Agency for Research on Cancer) сообщило, что к 2010 г. более 100 эпидемиологических исследований оценили связь между потреблением алкогольных напитков и риском развития РМЖ [30]. Комбинированный анализ данных 53 из этих исследований показал четкую прямую зависимость РМЖ от дозы потребления алкоголя [31]. Так, малые концентрации алкоголя (≤1 напитка в день – 10 г алкоголя) увеличивают риск РМЖ от 4 [32] до 10% [25]. Результаты британского исследования с участием 1 280 296 женщин пре- и постменопаузального возраста свидетельствуют, что увеличение ежедневного количества потребляемого алкоголя еще на 1 напиток повышает риск до 12% [33]. Данные проспективного когортного исследования 2016 г. во Франции с включением 67 634 женщин интересны тем, что указывают на значимые ассоциации алкоголя с риском РМЖ только у женщин постменопаузального, но не пременопаузального возраста [34]. Это означает, что механизм запуска канцерогенеза этанолом нуждается в детализации в целях четкого определения групп риска.

В эксперименте показано, что этанол в период полового созревания стимулирует морфологические изменения в МЖ, в частности, усиливает ветвление протоков, пролиферацию эпителия и приводит к повышению маммарной плотности [35]. Частота пролиферативных (предраковых) форм доброкачественной дисплазии МЖ (ДДМЖ) прямо коррелирует с употреблением алкоголя. Риск до первой беременности увеличен на 26% при ежедневном потреблении 5,0–14,9 г (~0,5–1,5 напитка) и на 39% при дозе ≥15 г.

Частота РМЖ на каждые 10 г алкоголя в сутки возрастает на 14% среди женщин, у которых интервал между менархе и первой гестацией составил 10–14 лет. Если данный временной промежуток увеличен до ≥15 лет (т.е. начало интоксикации приходится на более молодой возраст), распространенность заболевания существенно возрастает и составляет 25% [36]. Таким образом, воздействие алкоголя до первой беременности способно привести к морфологическим изменениям в тканях МЖ, предрасполагающим к канцерогенезу в дальнейшем. Более длительное воздействие этанола в течение восприимчивого периода существенно повышает возможность неотрансформации тканей. Раннее потребление алкоголя ассоциируется с более высоким риском развития РМЖ.

Метаболизм этанола до ацетальдегида, являющийся по существу этапом его активации, происходит не только в печени, но и в цитозоле и микросомах эпителия МЖ. Мутагенность и канцерогенность ацетальдегида как токсического вещества не подвергается сомнению. Концентрации данного органического соединения в ткани МЖ превышают таковые в плазме и в печени, пик их сохраняется до 15 ч при употреблении высокой дозы, 6 ч – при употреблении средней и 2 ч – при употреблении низкой дозы алкоголя. И, что наиболее важно, уровень продукта деградации спирта в плазме одинаков для всех трех доз этанола, т.е. печень способна быстро элиминировать этанол, чего нельзя сказать о МЖ [37]. Последствия накопления ацетальдегида в МЖ в течение длительного времени при его взаимодействии с ДНК, ядерными белками, липидами неблагоприятны. Результатом взаимодействия ацетальдегида с ДНК также является образование ее аддуктов, поэтому трактуется как процесс истинного канцерогенеза [38].

Этанол вовлекает ткани как печени, так и МЖ [37] в оксидативный стресс [32], т.е. создает дисбаланс между окислителями и антиоксидантами в пользу первых. Ответом на возникшее нарушение является повышение содержания в клетке реактивных форм кислорода, способных инициировать образование гидроперекисей. Радикалы, образующиеся при перекисном окислении липидов, повреждают молекулы ядерной и митохондриальной ДНК.

Задержка метаболизма и увеличение сывороточных концентраций эстрогенов [32] объясняется прямым повреждением гепатоцитов агрессивными производными этанола и развитием воспаления и цитолиза. Проблемой нарушенного метаболизма, помимо абсолютной гиперэстрогении, становится накопление гидроксиметаболитов и незавершение реакций их метилирования. Таким образом, замыкается порочный круг опосредованной алкоголем гиперэстрогенизации – повышение концентраций генотоксичных производных катехолэстрогенов [37].

Причиной депрессии метилирования является снижение печеночных запасов SAM. Во-первых, это инактивация MAT и чрезмерное расходование печенью SAM на дезинтоксикацию и процессы восстановления от окислительного стресса. Во-вторых, подавление синтеза эндогенного метионина ввиду несостоятельности реметилирования гомоцистеина. Причиной последнего является развивающийся дефицит фолиевой кислоты и бетаина вследствие их активного использования при одновременном нарушении депонирования [39]. Поэтому применение с лечебно-профилактической целью препаратов на основе фолиевой кислоты или SAM кажется вполне логичным.

В норме экспрессия стероидных рецепторов и пролиферация эпителиальных клеток МЖ наблюдаются в разных клеточных популяциях. Клетки, содержащие ERα, неизменно снабжены прогестероновыми рецепторами (PR). Эстрогены стимулируют биосинтез PR. ERα ответственны за эстроген-индуцированную пролиферацию эпителия МЖ, однако пролиферирующие эпителиальные клетки не экспрессируют ни ERα, ни PR. ERα/PR-положительные эпителиоциты чувствительны к воздействию стероидных гормонов и оказывают воздействие на пролиферативную деятельность смежных ERα/PR-негативных эпителиоцитов. И ERα, и ERβ могут самостоятельно обеспечивать пролиферацию эпителия МЖ. ERα при воздействии эстрогенов передают сигнал к запуску клеточной пролиферации, после чего биосинтез ER на время прекращается. После запуска пролиферация находится под контролем ERβ. Функция ERβ, постоянно находящихся в ядре клетки, заключается также в обеспечении повторного синтеза ERα, т.е. в восстанавлении чувствительности эпителиоцита к эстрадиолу [40].

Процессы пролиферации протокового и альвеолярного эпителия связаны с прогестерон-зависимыми факторами роста [40].

Q. Zhang и соавт. [41] показали, что этанол 10– 15-кратно увеличивает экспрессию генов ERα, с последующим усилением эффекта факторов транскрипции, ответственных за фенотипическую реализацию эффектов гормона.

Алкоголь ассоциируется с повышением риска как ER+/PR–, так и ER+/PR+ форм РМЖ, но не с ER–/PR– РМЖ [36]. В отличие от нормальной МЖ, эпителиоциты, обнаружившие склонность к канцерогенезу, способны одновременно и синтезировать рецепторы, и делиться [40]. Это означает, что корреляция ER+ и/или ER+/PR+ форм РМЖ с потреблением этанола объясняется усилением естественных процессов митотического деления на фоне гиперэстрогении и гиперкатехолэстрогении, но при наличии необратимых изменений в клеточной ДНК.

Влияние алкоголя на паттерны глобального и локального метилирования ДНК, вероятно, опосредованы его способностью снижать концентрации SAM, истощением запасов фолиевой кислоты, а также ингибированием основных ферментов одноуглеродного метаболизма [39].

В настоящее время предполагается существование двух основных механизмов канцеропромоции на фоне снижения уровня фолата: повышенная нестабильность ДНК и аберрантные образцы метилирования ДНК. Доказано, что при дефиците 5,10-MTHF тормозится процесс трансформации дезоксиуридинмонофосфата (dUMP) в дезокситимидина монофосфат (dTMP). В результате dUMP накапливается и затем избыточно интегрируется в новые молекулы ДНК, приводя к их повреждению (однонитевой или двунитевой разрыв молекулы) (см. рис. 2).

Большинство повреждений ДНК может быть исправлено в ходе репарации. Однако некоторые повреждения, а именно двунитевые разрывы, могут привести к эпигенетическим изменениям в виде метилирования окружающей ДНК и, как следствие, к «замолканию» гена. Также доказано, что эффекты алкоголя включают ингибирование активности и экспрессии ферментов, участвующих в ДНК-метилировании [32].

Известно, что у больных с мутациями генов MTHFR, MTR, MTRR нарушена система фолатного цикла (см. рис. 2), что сопровождается гипергомоцистеинемией и дефицитом метильных групп и сопряжено с изменениями эстрогенового метаболизма. Связь между распространенной гомозиготной мутацией С677Т гена MTHFR [42] и риском РМЖ неоднозначна. В частности, S. Zhong и соавт. [43] не обнаружили значимых ассоциаций РМЖ с наиболее распространенным вариантом полиморфизма гена MTHFR – A1298C. Однако метаанализ 35 исследований (19 527 случая) выявил четкую корреляцию данного варианта полиморфизма гена MTHFR с риском развития РМЖ и/или яичников [44].

По данным метаанализов, известные мутации A2756G гена MTR [43] и A66G гена MTRR [45] в азиатской популяции не коррелируют с частотой РМЖ. В то же время данные метаанализа 11 опубликованных исследований (8438 наблюдений [46] указывают на повышение восприимчивости к раку МЖ среди европейцев с распространенным вариантом полиморфизма гена MTR.

Различные популяции мира имеют выраженную генетическую гетерогенность по частоте генотипов и аллелей С677Т и А1298С полиморфизмов гена MTHFR, генов MTR, MTRR. Особого внимания заслуживает персонифицированная оценка риска РМЖ у больных с полиморфизмом генов фолатного цикла (с учетом модифицируемых факторов эпигенетического воздействия).

Связь метаболизма фолата с процессом реметилирования обязательно должна учитываться в программе реабилитации печеночного метаболизма после воздействия этанола. Имеется вариабельность депрессии печеночного метаболизма под влиянием «допустимых» и «токсических» доз алкоголя. Эпидемиологические данные о связи между применением фолатов с протективной целью и риском развития РМЖ у лиц, потребляющих алкоголь, весьма противоречивы. В частности, метаанализ перспективных когортных исследований (24 083 пациентки с РМЖ) показал, что прием фолата в дозе 220 мкг в день не оказывает существенного влияния на риск заболевания [RR 0,98 (0,90–1,05)] [47]. Другой метаанализ [48] продемонстрировал значительное снижение частоты РМЖ при применении фолиевой кислоты в дозе 153–400 мкг.

Таким образом, этиловый спирт в высоких дозах и/или при длительном применении прямо нарушает процессы клеточной жизнедеятельности, включая цикл метионина. Этанол является генетическим токсином для ДНК клеток всего организма, включая ткани МЖ. Именно поэтому физиологическая или алкоголь-ассоциированная гиперэстрогения вызывает усиление митозов в клетках с уже мутировавшей ДНК. Канцерогенность определяется несостоятельностью репарации и закреплению повреждений ДНК (мутаций) в следующих поколениях клеток. Эстрогены, как естественные регуляторы процессов пролиферации поддерживают митозы в клетках с измененной ДНК.

Полноценный метаболизм эстрогенов является важным условием предупреждения генетической токсичности метаболитов эстрогенов (трансформации их в хиноны). Нутритивная поддержка донаторами метильных групп и их переносчиков – фолиевой кислоты, витамина В12, бетаина, по-видимому, защищает от генотоксичности. Очень важным является изучение ассоциации потребления алкоголя с риском формирования доброкачественной патологии МЖ, с риском развития у этих же пациенток РМЖ после наступления менопаузы. Определение сывороточных концентраций фолиевой кислоты, витамина В12, связь этих параметров с активностью КОМТ представляет интерес для оценки индивидуального риска канцерогенеза МЖ. Остается открытым вопрос относительно интрамаммарной вариабельности экспрессии гена СОМТ как прогностического фактора у пациенток репродуктивного возраста с пролиферативными формами доброкачественной дисплазии МЖ.

Результаты исследований [49] свидетельствуют о том, что как активное, так и пассивное курение ассоциируются с увеличением риска РМЖ. Механизмы такой зависимости представляют немалый интерес, поскольку раскрытие их не только позволило бы мотивировать курильщиц на модификацию образа жизни, но и разработать меры профилактики заболевания для женщин, непроизвольно вдыхающих табачный дым.

Табачные алколоиды – никотин, котинин и их дериваты – изменяют метаболизм стероидов. В эксперименте in vitro доказана способность токсинов табака подавлять синтез эстрогенов путем снижения активности фермента ароматазы как в клетках гранулезы яичников, так и в клеточных линиях РМЖ [5]. Более того, исследование Health Study II (1996–1999 гг.) с участием 603 женщин пременопаузального возраста подтвердило снижение продукции эндогенных эстрогенов, правда, только в лютеиновую фазу менструального цикла. Концентрации 16-ОН-метаболитов у курильщиц были значимо ниже, чем у некурящих, что могло бы рассматриваться как благоприятный фактор прогноза РМЖ. Однако эти данные не позволяют соотнести курение со снижением риска РМЖ, поскольку воздействие табачного дыма сопровождается изолированным и значительным повышением проонкогенных 4-ОН-метаболитов эстрогенов [50].

J. Peng и соавт. [51] показали, что возрастание концентрации 4-ОН-эстрогенов происходит за счет 2,3-кратного увеличения экспрессии гена CYP1B1. Также отмечается снижение уровня мРНК СОМТ в 3,1 раза, т.е. имела место задержка трансформации 4-ОН-метаболита эстрогена в его метоксипроизводное. Никаких существенных изменений уровня мРНК CYP1A1 после воздействия табачного дыма не наблюдалось. Таким образом, потребность в активации гена СОМТ при курении резко возрастает, но его экспрессия не повышается, а подавляется.

Интересно, что тропность алкалоидов табака (в частности, никотина) к ацетилхолиновым рецепторам обеспечивает дополнительное абсолютное увеличение продукции катехоламинов (дофамина [52] и конечного продукта – адреналина [53]), конкурирующих с эстрогенами за метильные группы. КОМТ может инактивировать четырехкратно повышенные концентрации дофамина и катехоламинов в разнообразных клеточных культурах (нейроглии, фибробластах кожи) [54]. Подострое (повторяющееся) введение дофамина может сопровождаться быстрым метаболизмом этого нейромедиатора вследствие усиления экспрессии гена СОМТ и возрастания концентрации соответствующего фермента [55]. Это означает, что существует возможность компенсаторной реакции на гиперсекрецию катехоламинов и на сверхфизиологическую секрецию 4-гидроксиэстрогенов при длительном курении. Продолжительность такой адаптации требует изучения.

Таким образом, курение изменяет эстрогенную насыщенность организма, метаболизм эстрогенов, общий статус метилирования. «Обкрадывание» метилирования эстрогенов в условиях гиперкатехоламинемии может рассматриваться в качестве одного из факторов риска эстрогенопосредованной стимуляции рецепторов органов-мишеней и, соответственно, развития эстрогензависимых опухолей. Вопрос о возможностях резервной экспрессии гена CОМТ и ее связи с развитием любых форм дисплазии МЖ при хронической интоксикации катехоламинами остается открытым.

Природа относительного подавления гена СОМТ при курении вызывает значительный интерес. Предполагается, что «пассивность» СОМТ развивается по причине патологического гиперметилирования гена. Подтверждение этой гипотезы получено Q. Xu и соавт. [56], обнаруживших усиление метилирования CpG динуклеотидов в промоторной области гена СОМТ. Авторы связывают развитие никотиновой зависимости с ослабленностью экспрессии СОМТ.

Окислительный стресс, вызываемый табачным дымом, сопровождается широким спектром структурных повреждений ДНК. Такие нарушения приводят к дефекту связывания DNMT с собственно молекулой ДНК и, в итоге – к глобальному гипометилированию [57]. Как было показано выше, длительное гипометилирование формирует потребность гена в избирательном, но практически необратимом гиперметилировании. Действительно, к числу наиболее активных канцерогенов табачного дыма относятся так называемые полициклические ароматические углеводороды (ПАУ). Вызываемое ПАУ образование ДНК-аддуктов сочетается с аберрантным генспецифическим метилированием генов-супрессоров опухолей, в частности RARβ и APC и ассоциируется с заболеваемостью РМЖ [58].

Курение при беременности вносит дисрегуляцию в геном плода, в частности, в статус метилирования генов защиты от ксенобиотиков. Арил-гидрокарбоновый рецептор (AHR) – особый вид ядерных рецепторов, экспрессия которого индуцируется под действием наиболее распространенных в окружающей среде ПАУ и запускает транскрипцию генов системы детоксикации (CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1 и NQO1). Активация AHR под влиянием табачного дыма приводит к избыточному накоплению высоко реактивных метаболитов эстрогенов. Репрессор арил-гидрокарбонового рецептора (AHRR) экспрессируется в различных тканях организма и ингибирует AHR-сигнальный путь. Материнское курение приводит к внутриутробному усилению метилирования гена CYP1A1 на 2–7% и ослаблению метилирования AHRR на 3–8% [59], что может трактоваться как защита плода от сверхпродукции агрессивных цито- и генотоксичных молекул, в том числе производных эстрогенов.

Возможно, как и в случае с длительной интоксикацией алкоголем, продолжительное воздействие табака приводит к изменению ДНК стволовой клетки. Так, C. Breton и соавт. [57] показали, что влияние табачного дыма на детей в период пренатального развития изменяет метилирование ДНК различных генов. Отмечена активация метилирования гена рецепторной тирозинкиназы AXL, в норме способствующего антиапоптозу, митогенезу, инвазии и выживанию клеток, и уменьшение метилирования гена AluYb8, играющего роль модулятора апоптотического пути. Однако тотальное гиперметилирование сопряжено с сайленсингом не только генов-активаторов митозов, но и генов противоопухолевой защиты. Поэтому обнаруженные W. Besingi и соавт. [60] значимые ассоциации ДНК-гиперметилирования таких генов-супрессоров под влиянием компонентов табачного дыма у взрослых могут рассматриваться в качестве звеньев одной цепи гипометилирования-гиперметилирования.

Анализ изменений ДНК-метилирования в эмбрио- и онтогенезе чрезвычайно важен с точки зрения прогноза и ранней диагностики онкогенеза. Изучение механизмов воздействия на экспрессию генов ряда внешних факторов является одним из наиболее перспективных направлений персонализированной медицины.

РМЖ является самым распространенным опухолевым заболеванием в женской популяции. Доказательства отрицательного влияния на геном и эпигеном образа жизни с чрезмерным потреблением алкоголя и курением весьма убедительны. Длительное воздействие токсинов любого происхождения может повреждать ДНК клетки. Наличие промитогенных мутаций ДНК при поддержке естественных регуляторов пролиферации – эстрогенов создает базу для формирования опухолевого процесса. Дефицит метилирования эстрогенов лежит в основе гиперактивации эстроген-опосредованного клеточного деления. Обкрадывание процесса метилирования ДНК лежит в основе феномена «гипометилирования-гиперметилирования» – ведущей причины пассивности генов супрессоров опухолевого роста, а также гена СОМТ, ответственного за полную инактивацию эстрогенов. Профилактика РМЖ требует поиска абсолютных маркеров канцерогенеза на основе изучения не только фенотипа генов-супрессоров пролиферации, но и генов, контролирующих метаболизм эстрогенов. Интерес представляет оценка индивидуального риска злокачественной патологии МЖ на основе изучения экспрессии и метилирования гена СОМТ.

Источник финансирования. Поисково-аналитическая работа проведена на личные средства авторского коллектива.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, связанного с публикацией настоящей статьи, в том числе в связи со сбором, анализом и интерпретацией данных.

Участие авторов: оба автора внесли равный вклад в проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации.