Акромегалия (АМ) – эндокринное заболевание, причиной которого является избыточная продукция соматотропного гормона (СТГ). В подавляющем большинстве случаев источником гиперсекреции СТГ является аденома гипофиза. Распространенность АМ, по разным оценкам, составляет около 28–137 случаев на 1 млн населения [1]. Заболевание характеризуется длительным и в большинстве случаев малосимптомным течением, что способствует развитию осложнений со стороны органов и систем, росту аденомы гипофиза и увеличению смертности [2]. Методом первой линии в лечении АМ является оперативное вмешательство: транссфеноидальная аденомэктомия. Частота ремиссий после операции зависит от размера образования и от его анатомического расположения. В случае неэффективности хирургического лечения возможно проведение повторной операции или назначение медикаментозной терапии.

Существует несколько классов препаратов для медикаментозного лечения АМ: агонисты рецепторов дофамина, аналоги соматостатина, антагонисты рецептора СТГ [3]. К основным нерешенным проблемам медикаментозного лечения относятся высокая стоимость препаратов, а также сложность в определении категорий пациентов, которые будут чувствительны к такому лечению [4]. Данные проблемы диктуют необходимость поиска новых биомаркеров активности заболевания и предикторов ответа на консервативную терапию.

МикроРНК – класс малых некодирующих молекул РНК, участвующих в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов. В настоящее время микроРНК активно изучаются, поскольку участвуют в патогенезе многих заболеваний. Кроме того, они определяются во всех биологических жидкостях человека в относительно стабильных концентрациях, в связи с чем их можно рассматривать в качестве потенциальных биомаркеров эндокринных заболеваний [5].

Изменения экспрессии микроРНК в аденомах гипофиза – предмет интереса и активного изучения в научном сообществе. Со времен первой публикации A. Bottoni и соавт. [6], которые обнаружили снижение экспрессии miR-15a и miR-16-1 в аденомах по сравнению с нормальной тканью гипофиза, было проведено большое количество исследований, в которых соматотропиномы сравнивались с аденомами, секретирующими другие тропные гормоны, и с гормонально-неактивными аденомами. Также анализировались различия тканевой экспрессии микроРНК в зависимости от размера соматотропином, их агрессивности, гистотипа, экспрессии рецепторов соматостатина и чувствительности к лечению аналогами соматостатина. Стоит отметить, что, несмотря на полученные различия, согласованные изменения в различных публикациях достаточно редки [7]. В циркуляции микроРНК анализировались как маркеры костного метаболизма у пациентов с активной акромегалией [8] и на фоне ремиссии акромегалии [9]. В обоих исследованиях изучалось содержание предварительно выбранного списка микроРНК методом количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. Также экспрессия микроРНК исследовалась в образцах костной ткани при акромегалии [10].

Существуют различные способы оценки экспрессии циркулирующих микроРНК. В настоящее время основными являются Nothern blotting, полимеразная цепная реакция (ПЦР), количественная ПЦР с обратной транскрипцией (qRT-PCR), микроРНК-микрочипы и высокопроизводительное секвенирование (или next-generation sequencing, NGS). Для нашего исследования мы выбрали метод высокопроизводительного секвенирования. Достоинствами данного метода являются большая пропускная способность, низкие требования к количеству РНК для анализа, возможность получения корректных и качественных данных при более широком диапазоне определения микроРНК, а также обнаружения изомеров микроРНК (isomiR) и новых микроРНК. К недостаткам данного метода относятся высокая стоимость и необходимость многокомпонентного биоинформатического анализа получаемых данных. Кроме того, данные, полученные при помощи NGS, необходимо подтверждать дополнительным методом оценки экспрессии, в качестве которого наиболее часто используется qRT-PCR [8].

Определить циркулирующие микроРНК, различно экспрессирующиеся у пациентов с акромегалией по сравнению со здоровым контролем.

Дизайн исследования

Проведено одноцентровое, одномоментное, выборочное исследование случай-контроль.

Критерии соответствия

Критерии включения: активная стадия АМ, подтвержденная типичными клиническими проявлениями, повышением ИРФ-1 (согласно возрастному референсному диапазону) и отсутствием подавления секреции СТГ до концентрации <1,0 нг/мл в ходе перорального глюкозотолератного теста (ПГТТ).

Критерии исключения: прием аналогов соматостатина в анамнезе или на момент включения в исследования; лучевая терапия в анамнезе; акромегалия вследствие генетических синдромов.

В качестве контрольной группы выбраны здоровые добровольцы без клинических проявлений эндокринных заболеваний.

Условия проведения

Набор пациентов и забор биологического материала проводились на базе отделения нейроэндокринологии и остеопатий ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России. Выделение микроРНК и биоинформатический анализ результатов секвенирования проводились на базе ФГБУ «НИИпульмонологии» ФМБА России. Высокопроизводительное секвенирование проводилось на базе лаборатории «Геномед».

Продолжительность исследования

Набор пациентов и материала для биобанка проведен в период с декабря 2016 г. по декабрь 2017 г.

Описание медицинского вмешательства

Пациентам проводился забор цельной крови утром натощак. В течение 30 мин после забора крови образцы цельной крови однократно центрифугировались (лабораторная центрифуга Eppendorf 5810R с комплектом роторов (А-4-81, Ф-4-81-MTP/Flex, FA-45-30-11 и F-45-48-PCR) при температуре +5 °С на скорости вращения 3000 об/мин в течение 20 мин. Далее образцы плазмы раскапывались в криопробирки, замораживались и хранились при температуре –80 °C.

Основной исход исследования

В качестве конечных точек исследования фиксировали показатели экспрессии циркулирующих микроРНК.

Анализ в подгруппах

Сравнение показателей проведено между двумя основными группами – пациентов с акромегалией и здоровыми добровольцами. Разделение на подгруппы не проводилось.

Методы регистрации исходов

Выделение микроРНК из 200 мкл плазмы проводили с помощью miRNeasy Serum/Plasma Kit («Qiagen», Германия) согласно инструкции компании-производителя, на автоматической станции QIAcube («Qiagen», Германия). Для предотвращения деградации в выделенную РНК добавляли 1 ед. RiboLock RNase Inhibitor («Thermo Fisher Scientific», США) на 1 мкл раствора нуклеиновых кислот. Концентрацию суммарной РНК в водном растворе оценивали на спектрофотометре NanoVue Plus («GE Healthcare», Великобритания).

Полногеномный анализ экспрессии микроРНК был выполнен на высокопроизводительном секвенаторе NextSeq с помощью TruSeq Small RNA Library Prep Kit. Биоинформатический анализ выполнялся с помощью программного обеспечения atropos (удаление адаптеров), STAR (выравнивание), FastQC (контроль качества), seqbuster/seqcluster/miRge2 (аннотация микроРНК, поиск isomiR, поиск новых микроРНК, анализ экспрессии).

Концентрацию ИФР-1 измеряли с помощью иммунохемилюминесценции (Liaison). Возрастные референсные диапазоны:

– 18–20 лет: 127–584 нг/мл;

– 21–25 лет: 116–358 нг/мл;

– 26–30 лет: 117–329 нг/мл;

– 31–35 лет: 115–307 нг/мл;

– 36–40 лет: 109–284 нг/мл;

– 41–45 лет: 101–267 нг/мл;

– 46–50 лет: 94–252 нг/мл;

– 51–55 лет: 87–238 нг/мл;

– 56–60 лет: 81–225 нг/мл;

– 61–65 лет: 75–212 нг/мл.

Этическая экспертиза

Исследование одобрено локальным этическим комитетом при ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России. Протокол заседания № 20 от 14 декабря 2016 г.

Статистический анализ

Размер выборки предварительно не рассчитывался ввиду редкости заболевания и пилотного характера исследования. Сравнение описательных параметров пациентов с АМ и группы контроля с использованием непарных двусторонних t-тестов. Для сравнения качественных параметров двух независимых групп использован точный критерий Фишера. Значение p<0,05 считалось статистически достоверным. Вся аналитическая статистика выполнена с использованием базового пакета «stats».

Биоинформатический анализ данных секвенирования выполнен при помощи пакета DESeq2. Поправка на множественную проверку гипотез выполнена методом Бенджамини–Хохберга [9].

Объекты (участники) исследования

В исследование включены 12 пациентов с АМ и 12 здоровых добровольцев. Исходные характеристики участников исследования представлены в табл. 1.

Таблица 1. Сравнительная характеристика участников исследования

Основные результаты исследования

По результатам биоинформатического анализа выявлены четыре микроРНК, экспрессия которых снижена в плазме крови у пациентов с АМ по сравнению со здоровыми добровольцами: miR-4446-3p, miR-215-5p, miR-342-5p и miR-191-5p (табл. 2). Однако после поправки на множественную проверку гипотез экспрессия представленных микроРНК не достигла достоверных различий.

Таблица 2. МикроРНК, различно экспрессирующиеся в плазме крови пациентов с акромегалией по сравнению со здоровыми добровольцами

Примечание.* – поправка на множественную проверку гипотез методом Бенджамини−Хохберга.

Нежелательные явления

В ходе исследования нежелательные явления не фиксировались.

Резюме основного результата исследования

В представленном исследовании впервые проведен анализ экспрессии циркулирующих микроРНК плазмы крови у пациентов с АМ методом высокопроизводительного секвенирования. Полученные данные позволяют установить гипотезу о том, что miR-4446-3p, miR-215-5p и miR-342-5p, miR-191-5p различно экспрессируются у пациентов с АМ по сравнению со здоровым контролем.

Обсуждение основного результата исследования

Настоящее исследование является первой работой по оценке профиля экспрессии микроРНК в периферической крови пациентов с активной АМ методом высокопроизводительного секвенирования. Ранее методом qRT-PCR был проведен анализ экспрессии микроРНК, которые предположительно участвуют в регуляции костного метаболизма [8–10]. Так, в исследовании Т.А. Гребенниковой и соавт. [10], было обнаружено снижение экспрессии miR-100-5p, miR-550a-5p, miR-7b-5p, miR-96-5p в плазме крови у пациентов с активной АМ по сравнению со здоровым контролем. Однако авторам этого исследования не удалось выявить связей между экспрессией микроРНК в костной ткани и плазме у пациентов с АМ [8,10]. Эти микроРНК не отличались у пациентов с АМ и здорового контроля и в нашем исследовании, возможно, из-за снижения чувствительности при анализе большого количества микроРНК. E. Valassi и соавт. [11] изучали экспрессию циркулирующих микроРНК сыворотки, предположительно участвующих в метаболизме кости, у пациентов с компенсированной АМ по сравнению со здоровым контролем. Обнаружены различия в экспрессии miR-103a-3p, miR-191-5p, miR-660-5p, при этом изменения в экспрессии коррелировали с показателями минерально-костного обмена и МПК, что позволяет предположить участие микроРНК в патогенезе костных нарушений и возможность их использования в качестве биомаркеров. Интересно, что miR-191-5p была понижена в плазме пациентов с активной АМ в нашем исследовании, но стала повышенной у пациентов с ремиссией АМ [9]. Возможно, изменения в экспрессии данной микроРНК отражают активность заболевания. Мы не обнаружили различий по miR-103a-3p и miR-660-5p.

На момент подачи рукописи нам не удалось найти данных по измененной экспрессии miR-4446-3p, miR-215-5p, miR-342-5p и miR-191-5p в аденомах гипофиза [12]. Вместе с тем, согласно данным литературы [13], экспрессия miR-4446-3p повышена в сыворотке при раке молочной железы. Кроме того, B. Kim и соавт. [14] отметили повышение экспрессии miR-4446-3p после компрессии клеток из линии агрессивного низкодифференцированного рака молочной железы – MDA-MB-231. В исследовании J. Wang и соавт. [15] отмечено снижение экспрессии miR-4446-3p в сыворотке у пациентов с резистентной к лечению эпилепсией по сравнению с пациентами, чувствительными к терапии. Экспрессия miR-215-5p повышена в сыворотке пациентов с остеосаркомой по сравнению со здоровым контролем [16]. По данным Vychytilova-Faltejskova P. и соавт. [17], экспрессия miR-215-5p повышена в тканях опухоли при колоректальном раке, а ее экспериментально подтвержденными мишенями являются различные звенья EGFR – каноничного сигнального пути патогенеза колоректального рака.

Экспрессия miR-342-5p повышена в периферических мононуклеарных клетках у пациентов с ишемической болезнью сердца по сравнению со здоровым контролем, кроме того, отмечена прямая корреляция с воспалительными цитокинами. Авторы делают вывод о регулирующей роли miR-342-5p в процессах атеросклероза и секреции цитокинов, хотя необходимо больше исследований в данном направлении [18]. Также экспериментально подтверджено, что miR-342-5p является многофункциональным репрессором ангиогенеза в эндотелиоцитах [19]. Согласно исследованию на клеточных линиях колоректального рака SW480 и SW620, мишенью miR-342-5p в этих клетках является мРНК гена N-a-acetyltransferase 10 protein (NAA10). Подавляя его, miR-342-5p осуществляет репрессию туморогенеза. Нарушения регуляции данного гена ассоциированы с различными онкологическими заболеваниями у человека, включая колоректальный рак. Данные результаты были подтверждены исследованиями в тканях при колоректальном раке у человека: обнаружена обратная корреляция между экспрессией miR-342-5p и NAA10 [20].

По данным Rosignolo F. и соавт., экспрессия miR-191-5p повышена в сыворотке у пациентов с папиллярным раком щитовидной железы по сравнению со здоровым контролем [21]. MiR-191-5p является одним из компонентов панели из семи микроРНК плазмы, которые позволяют отличить пациентов с болезнью Альцгеймера от здоровых с точностью более 95%: между группами экспрессия каждой микроРНК панели отличается более чем в 2 раза [22]. Повышение экспрессии miR-191-5p в клеточных линиях рака молочной железы MCF7 и ZR-75 приводит к ингибированию апоптоза, прямой мишенью miR-191-5p является SOX4. [23] Экспрессия miR-191-5p повышена в сыворотке при рассеянном склерозе по сравнению со здоровыми добровольцами [24]. Также экспрессия данной микроРНК повышена в периферических мононуклеарных клетках при синдроме дефицита внимания по сравнению со здоровыми добровольцами [25].

Таблица 3. Некоторые мишени микроРНК, представленные в базе TargetScan

Прямое действие микроРНК на мишени сложно определить, так как каждая микроРНК может большое количество мишеней. Существуют биоинформатические базы данных, в которых содержится информация о предполагаемых взаимодействиях между микроРНК и мРНК-мишенями на основе их комплементарности – TargetScan [26], miRanda [27], DIANA-microT [28], PicTAR [29] и др. Мы провели поиск взаимодействий выявленных микроРНК при помощи TargetScan. Результаты оцениваются согласно индексу cumulative weighted context++ score, отражающему вклад 14 показателей вероятности связывания – значения в диапазоне от 1 до –3. Чем меньше значение – тем больше вероятность взаимодействия [30].

Результаты поиска в базе TargetScan представлены в табл. 3. Семейство транскрипционных факторов SOX – белки, играющие ключевую роль в развитии органов и систем человека [31], в том числе в эмбриональном развитии гипофиза [32]. Сигнальный путь NOTCH регулирует процессы эмбриогенеза и поддержания гомеостаза тканей и органов человека, его влияние на внутриклеточные сигнальные пути определяет судьбу клетки [33]. Описаны различия в экспрессии компонентов данного сигнального пути в аденомах гипофиза различных гистотипов [34]. PRKAR1A является геном-супрессором опухолевого роста, кодирующим 1-α регуляторную субъединицу цАМФ зависимой протеинкиназы A. Существует взаимосвязь между мутациями в гене PRKAR1A и возникновением Карни-комплекса – заболеванием, характеризующимся возникновением миксом сердца, кожи и других тканей, а также новообразований гипофиза, щитовидной железы, надпочечников и других эндокринных органов. Мутация PRKAR1A обнаруживается приблизительно у 70% пациентов с Карни-комплексом [35]. Уровень экспрессии рецепторов соматостатина 2-го и 5-го подтипов является предиктором чувствительности к аналогам соматостатина первого поколения [36].

Указанные взаимодействия необходимо подтвердить экспериментально, поскольку для того, чтобы взаимодействие между микроРНК и мишенью состоялось, необходимо чтобы они находились в одной клетке в одно и то же время. Кроме того, уровень экспрессии должен быть достаточным для репрессии трансляции [37]. По данным литературы, из представленных взаимодействий экспериментально подтверждались miR-215-5p и PRKAR1A [38], а также miR-4446-3p и NOTCH2 [39].

Исходя из анализа данных литературы, одна и та же микроРНК может участвовать в различных физиологических и патологических процессах. Определение одних и тех же микроРНК в качестве биомаркеров различных заболеваний поднимает вопрос специфичности данных изменений. Представляется перспективным исследование нескольких микроРНК в качестве диагностической панели, что позволит повысить специфичность метода.

Ограничения исследования

Ограничениями представленного исследования являются малый размер выборки и отсутствие валидизации полученных результатов другим методом оценки экспрессии циркулирующих микроРНК. Исследование большого количества микроРНК методом высокопроизводительного секвенирования зачастую не позволяет достичь статистически достоверного результата с применением поправки на множественные сравнения, поэтому результат необходимо подтверждать проведением других методов анализа, в частности, qRT-PCR, при этом в литературе встречаются публикации, в которых NGS использовался как единственный метод оценки экспрессии [40–42]. По результатам представленного исследования установлена гипотеза о различиях в экспрессии циркулирующих микроРНК между представленными группами.

В представленном исследовании впервые использован метод высокопроизводительного секвенирования для оценки экспрессии микроРНК плазмы у пациентов с АМ. Выявлено снижение экспрессии miR-4446-3p, miR-215-5p и miR-342-5p, miR-191-5p – микроРНК, которые связаны с патогенезом различных онкологических заболеваний: колоректального рака, рака молочной железы и папиллярного рака щитовидной железы, что представляет интерес для дальнейших исследований, учитывая повышенный риск онкологических заболеваний при АМ.

Нам не удалось подтвердить полученные ранее данные по измененной экспрессии микроРНК, участвующих в минерально-костном обмене, что может быть связано с различиями в исходном материале (сыворотка или плазма), с малым размером выборки в представленном исследовании или иными факторами. Учитывая отсутствие достоверности по вышеуказанным изменениям при применении поправки на множественность сравнений, необходимо проведение дальнейших исследований на большей выборке с использованием валидизирующего метода. При выявлении достоверных различий перспектива научного применения заключается в изучении прогностической ценности циркулирующих микроРНК в отношении активности АМ, послеоперационного прогноза и чувствительности к консервативному лечению.

Источник финансирования. Исследование проведено при поддержке Российского научного фонда (проект № 19-15-00398).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов: Ж.Е. Белая, Г.А. Мельниченко, А.С. Луценко – концепция и научное руководство исследования; А.С. Луценко, П.М. Хандаева – сбор материала; А.Г. Никитин, Ф.А. Кошкин – выделение РНК и анализ экспрессии микроРНК; А.Г. Никитин, А.С. Луценко – статистическая обработка данных; А.С. Луценко – написание основного текста рукописи; Ж.Е. Белая, Е.Г. Пржиялковская, А.Г. Никитин, Г.А. Мельниченко, А.М. Лапшина – редактирование текста рукописи. Все авторы внесли значимый вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию статьи перед публикацией.