Лиганды, способные связываться с опиоидными рецепторами, можно условно разделить на две основные группы: первая представлена широким спектром низкомолекулярных соединений, в первую очередь морфином и его производными, которые используются в практической медицине в качестве анальгетиков, вторая группа – это эндогенные опиоидные пептиды, выполняющие в организме, помимо антиноцицептивной, еще ряд важных функций, в том числе иммунорегуляторную. Наиболее полно описано иммуномодулирующее действие трех основных семейств опиоидных пептидов: эндорфинов, энкефалинов и динорфинов, имеющих общую N-концевую последовательность и образующихся при расщеплении крупных молекул-предшественников [1]. Однако в конце XX в. были идентифицированы еще два пептида, взаимодействующих с опиоидными рецепторами, – эндоморфин 1 (ЭМ-1) и эндоморфин 2 (ЭМ-2) [2]. Несмотря на то что основным местом локализации соединений с опиоидной активностью является центральная нервная система (ЦНС), где они в первую очередь ответственны за антиноцицепцию, опиоидные пептиды также широко распространены в центральных и периферических органах иммунной системы, продуцируются клетками в ответ на контакт с антигеном либо в присутствии высоких концентраций провоспалительных цитокинов, обусловливая широкий спектр иммунорегуляторных эффектов, реализуемых по пара- и аутокринному механизму [3]. В настоящем обзоре мы попытались суммировать и систематизировать современные представления о структуре эндоморфинов и их иммуномодулирующих эффектах.

ЭМ-1 и ЭМ-2 были впервые идентифицированы в мозге быка и коре головного мозга человека в 1997 г. [2, 4]. Они представляют собой два тетрапептида, отличающихся по одному аминокислотному остатку. Структура эндоморфинов отличается от структуры эндорфинов, энкефалинов и динорфинов, которые содержат одинаковую N-концевую последовательность Tyr-Gly-Gly-Phe. Эндоморфины не имеют общей N-концевой последовательности, а эндогенный предшественник эндоморфинов до сих пор не идентифицирован [5]. Химическая структура эндоморфинов представлена на рис. 1. Последовательность эндоморфинов содержит спейсер Pro2, который соединяет между собой два фармакофорных остатка. Спейсер Pro2 обеспечивает необходимую стереохимическую конфигурацию ЭM-1 для связывания с рецептором. Биологически активной конформацией ЭМ-1 является структура, в которой боковые цепочки Tyr1 и Trp3 имеют противоположную ориентацию по отношению к Pro2 [6].

Рисунок 1. Структура эндоморфинов.

В центральной нервной системе эндоморфины распределены всюду. Этими пептидами изобилуют промежуточный мозг, средний мозг, структуры продолговатого и заднего мозга. ЭМ-1 доминирует в головном мозге, в то время как ЭМ-2 более распространен в спинном мозге [6, 7] и его распределение совпадает с зонами, богатыми β-эндорфином [8]. В органах иммунной системы эндоморфины обнаружены в клетках периферической крови, тимусе и селезенке [9], также в цитоплазме иммунокомпетентных клеток очага воспаления, и практически отсутствовали в невоспаленной ткани [10]. По данным Seale J.V. с соавт., области селезенки крыс с высоким содержанием ЭМ-1 и ЭМ-2 совпадали преимущественно с зонами преобладания макрофагов и В-лимфоцитов, минимальные количества пептидов присутствовали в зонах с преобладанием популяций Т-лимфоцитов [11]. В условиях хронического воспаления в модели адъювантного артрита ЭМ-1 и ЭМ-2 обнаружены в макрофагах/моноцитах медуллярной зоны подколенных лимфатических узлов крыс [12]. У человека ЭМ-1 и ЭМ-2 обнаружены в экстрактах лимфоцитов периферической крови, а в клетках селезенки – только ЭМ-2 [9]. Стабильность эндоморфинов довольно низкая, но в ЦНС период полураспада значительно выше (88 мин для ЭМ-1 и 105 мин для ЭМ-2), чем в плазме крови (4 мин для ЭМ-1 и 7 мин для ЭМ-2) [13]. В общем, эндоморфины относительно более стабильны, чем энкефалины, эндорфины и динорфины, благодаря наличию пролинового остатка во второй позиции [14, 15]. Показано, что внедрение жирных кислот и сахаров в структуру некоторых пептидов значительно улучшает их фармакологические свойства [16–18]: увеличиваются биодоступность, стабильность молекулы к ферментативному расщеплению, а также проницаемость через биологические барьеры методом пассивной диффузии (эндоцитоз) [19].

Основной сайт связывания для эндоморфинов – это μ-опиоидный рецептор (μОР), оба пептида дозозависимо вытесняли налоксон, Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-Gly-ol (DAMGO), и другие лиганды, селективные по отношению к μОР [20]. μОР, помимо центральной и периферической нервной системы, экспрессируется на клетках центральных и периферических органов иммунной системы [21], в зонах с высокой концентрацией эндоморфинов [12]. В 1999–2000 гг. высказаны предположения, что ЭМ-1 и ЭМ-2 оказывают свои биологические эффекты, стимулируя функционально разнообразные подтипы μОР (μ1 и μ2) [22]. Гетерогенность μОР была подтверждена во многих исследованиях антиноцицептивных и поведенческих эффектов этих пептидов и в настоящее время объясняется наличием 19 сплайс-вариантов μ-ОР у человека, 30 – у мышей и 16 – у крыс [23], а также процессами олигомеризации, гетеромеризации и гомомеризации [24–26]. Обнаружены формы μОР с 6 трансмембранными доменами, которые экспрессируются преимущественно на внутриклеточных мембранах и могут участвовать в передаче внутриклеточного сигнала [27]. Подобно другим пептидным агонистам, эндоморфины способны вызывать интернализацию μОР [28, 29].

Помимо этого, ЭМ-2, связываясь с μОР, стимулирует выброс других опиоидных пептидов, в частности мет-энкефалина и динорфина, которые, в свою очередь, реализуют эффекты уже через δ- и κ-опиатные рецепторы (δОР и κОР) соответственно. Похожие свойства, но только в отношении секреции мет-энкефалина, обнаружены и у β-эндорфина [7].

Несмотря на многочисленные доказательства, некоторые работы не поддерживают идею исключительной селективности эндоморфинов к μОР [30]. Показано, что эндоморфины имеют некоторую аффинность к тахикининовым рецепторам NK1 и NK2 [31], а ЭМ-2 к тому же обладает способностью связываться с рецептором к субстанции Р (SP1-7) [14]. Таким образом, в регуляции физиологических процессов эндоморфинами могут принимать участие альтернативные сайты, отличные от опиоидных.

Опиатные рецепторы относятся к суперсемейству G-протеин-сцепленных рецепторов. Проведение сигнала с опиатных рецепторов опосредуется главным образом гетеротримерными Gαi/o-белками [32], в меньшей степени в проведении сигнала могут участвовать и Gαs-белки [33]. Активация Gαs-белков запускает классический сигнальный каскад, связанный с активацией аденилатциклазы (аденилатциклаза (AC) – циклический аденозинмонофосфат (сAMP), протеинкиназа А (РКА) – CREB (транскрипционный фактор)). Активация Gαi/о-белков, напротив, блокирует аденилатциклазную активность [34]. Продукция cAMP клетками иммунной системы может как стимулироваться, так и угнетаться, в зависимости от целого ряда сопутствующих условий: видовой принадлежности объекта исследования или клеточной линии, типа экспрессируемых опиатных рецепторов, концентрации лиганда, времени воздействия, а также наличия дополнительных стимулов [35].

Интересно, что эндоморфины – единственные из всех опиоидных пептидов, которые являются частичными агонистами опиатных рецепторов. Все остальные опиоидные пептиды являются полными агонистами своих рецепторов. Теоретически это должно проявляться в том, что высокая доза эндоморфинов будет ослаблять эффекты других опиоидных пептидов. Действительно, показано, что эндоморфины ослабляют эффекты β-эндорфина у мышей. C другой стороны, в определенных физиологических условиях, когда μОР оказываются в состоянии «сверхстимуляции», эндоморфины могут предотвратить чрезмерную активацию μОР β-эндорфином по отрицательной обратной связи в тех тканях, где присутствуют как эндоморфины, так и β-эндорфин [7].

Есть данные о том, что цепь внутриклеточных событий, запускаемая при активации μОР, зависит от времени лиганд-рецепторного взаимодействия. Например, на линии клеток яичников китайских хомяков (СHO-клетках), стабильно экспрессирующих μOR, показано, что при взаимодействии эндоморфинов с μOR на протяжении 10 мин значимо снижается концентрация внутриклеточного cAMP, тогда как при длительном культивировании клеток-мишеней с пептидами (18 ч) происходит суперактивация AC и, соответственно, значительно повышается концентрация cAMP в клетках [36]. Это может происходить через повышение экспрессии GNAS1 гена, кодирующего α-субъединицу G-белка [33]. Также при хроническом воздействии опиатных агонистов ключевую роль в увеличении активности AC и накоплении cAMP могут играть Src-киназы [37]. С помощью предварительной обработки клеток коклюшным токсином (РТХ) было показано участие Gi/o белков в процессе суперактивации АС. Показано, что влияние агонистов MOR на активность сАМР опосредуется, вероятнее всего, через АС-I и AC-V. Активность AC-II, напротив, повышается при кратковременном воздействии эндоморфинов и снижается при продолжительном действии пептидных молекул [36].

Как правило, активация опиатных рецепторов приводит к ингибированию N-, P/Q-, L- и T-кальциевых каналов в пресинаптических нервных окончаниях, что приводит в конечном итоге к снижению выброса нейротрансмиттеров. Однако в работе Block L. и соавт. (2012) приведены данные о том, что культивирование астроцитов в присутствии ЭМ-1 приводит к увеличению концентрации ионов Ca2+ в среде культивирования [38]. Есть данные, что при активации μOR морфином в клетках иммунной системы важное значение имеет опосредованный фосфоинозитид-3-киназой/протеинкиназой В (PI3K/ATK) сигнальный механизм [39].

Адаптивный иммунитет

Показано, что добавление ЭМ-1 и ЭМ-2 к спленоцитам мыши in vitro приводило к дозозависимому угнетению продукции антител против эритроцитов барана. Максимальный эффект наблюдался при использовании пептидов в концентрациях 10-13–10-15 M. Авторы не смогли подтвердить участие μOP в реализации полученных эффектов, так как блокада опиатных рецепторов налоксоном или селективным антагонистом μОР (СТАР) не отменяла супрессию, вызванную эндоморфинами. Однако внесение моноклональных антител к эндоморфинам полностью отменяло их эффекты, что полностью подтверждает специфичность действия тетрапептидов [40]. Эндоморфины могут регулировать выраженность реакции гиперчувствительности. Установлено, что гибридный пептид PK20, включающий в свой состав аналог ЭМ-2 и модифицированный фрагмент нейротензина (8-13), снижает интенсивность кожной реакции на динитрофторбензол и угнетает локальную продукцию IL-1α, MCP-1, TNF-α [41]. В литературе есть данные об антипролиферативном эффекте эндоморфинов, поскольку они способны регулировать интенсивность пролиферации через усиление апоптотических процессов. Показано, что ЭМ-1 и ЭМ-2 понижали экспрессию Bcl-2 протеина и усиливали экспрессию Bax, Fas и FasL в клетках опухолевой линии HL-60, таким образом индуцируя апоптоз в клетках HL-60 за счет активации Bcl-2-Bax и Fas-FasL-пути [42]. В то же время хронический воспалительный процесс в мочевом пузыре, индуцированный зимозаном, способствует снижению концентрации ЭМ-2 в грудном и поясничном отделах спинного мозга [43].

Врожденный иммунитет

Исследователями из японского Департамента фармакологии было показано, что оба тетрапептида в фармакологических концентрациях 10-6–10-8 М угнетают индуцированную липополисахаридом (ЛПС) продукцию IL-10 и IL-12 макрофагальной клеточной линией THP-1 [44], а также перитонеальными макрофагами крыс в ответ на ЛПС и форболмиристатацетат (ФМА) [45]. Помимо этого, было установлено, что ЭМ-2 у крыс оказывал разнонаправленные эффекты на секрецию основных противовоспалительных цитокинов, ингибируя продукцию TNF-a, но стимулируя секрецию IL-1β [44]. В настоящее время существуют работы, объясняющие этот феномен тем, что регуляция экспрессии IL-1β в ЛПС-стимулированных культурах происходит на транскрипционном уровне, в то время как в отношении TNF-α – экспрессия регулируется посттранскрипционно [46, 47]. По данным других авторов, ЭМ-1 и ЭМ-2 снижают продукцию и TNF-α, и IL-1β нестимулированными перитонеальными макрофагами крыс спустя 12 и 24 ч воздействия в диапазоне концентраций 10-6–10-9 М, при этом более выраженный эффект был зарегистрирован у ЭМ-1 [48].

Есть данные о том, что совместное культивирование макрофагов с ЭМ-1 значимо снижает содержание TNF-α и, напротив, увеличивает содержание IFN-γ в клеточных супернатантах, по сравнению с контрольными культурами, а также налоксон-зависимо снижает экспрессию CD36 на макрофагах, оказывая таким образом противовоспалительный и антиатерогенный эффекты [49]. Помимо этого, показано, что ЭМ-1 угнетает продукцию IL-8 клеточной линией аденокарциномы толстого отдела кишечника Сaco-2, стимулированной IL-1β [50].

В ряде работ показана способность эндоморфинов модулировать фагоцитарную активность эффекторов врожденного иммунитета. Группой японских исследователей получены данные о способности ЭМ-2 усиливать экспрессию CR-3 (Мас-1) на поверхности перитонеальных макрофагов крыс, повышать адгезию макрофагов к фибронектину, угнетать хемотаксис макрофагов и подавлять спонтанную продукцию супероксиданионов. В то же время, несмотря на усиление экспрессии Мас-1, под воздействием ЭМ-2 наблюдалось угнетение фагоцитоза опсонизированной E. coli [44]. Аналогичные эффекты ЭМ-2 на фагоцитарную активность и хемотаксис были получены в культурах человеческих моноцитов [51] и при культивировании THP-1 клеточной линии [44]. С представленными выше результатами согласуются и данные о влиянии ЭМ-1 и ЭМ-2 на фагоцитарную активность и бактерицидность в культурах перитонеальных макрофагов крыс [48].

Эндоморфины также модулируют функции нейтрофильных гранулоцитов. Так, показано, что в ответ на ЭМ-1 и ЭМ-2 (10-6–10-18М) в стимулированных фитогемагглютинином (ФГА) нейтрофилах крыс снижается продукция супероксиданиона, а в нестимулированных культурах наблюдается обратная картина, при этом подтверждено участие μОР в исследуемых процессах [52]. Кроме этого, под воздействием эндоморфинов наблюдалась стимуляция хемотаксиса, но фагоцитарная активность нейтрофилов при этом не изменялась [53]. Выше упоминалось, что антиноцицептивные эффекты ЭМ-2 при введении пептида в ЦНС не возникают при блокаде κ-опиатных рецепторов, этот феномен авторы объясняют тем, что при интрацеребровентрикулярном [54] введении ЭМ-2 активация его рецепторов приводит к мобилизации эндогенного динорфина А, который, возможно, и обеспечивает антиноцицептивный эффект этого пептида. Было показано, что угнетение образования активных форм кислорода нейтрофилами in vitro под воздействием эндоморфинов не возникало после воздействия β-фуналтрексамином (β-FNA), но не антагонистом κ-опиатных рецепторов [55].

Показано, что эндоморфины участвуют в регуляции NO – короткоживущего радикала, вовлеченного в процессы воспаления, передачи нервных импульсов, апоптоза и регуляцию сосудистого тонуса. В статье Saric A. и соавт. показано, что только ЭМ-1 стимулирует выделение NO спустя 30 мин после активации индуцибельной NO-синтазы (NOS 2), этот эффект был опосредован через μОР. При длительной инкубации (48 ч) эффект тетрапептидов отсутствовал. Авторы объясняют это тем, что в данном случае эффект скорее был опосредованным и определялся цитокинами, нежели прямым взаимодействием эндоморфинов с рецепторами [56]. В 2010 г. еще один авторский коллектив подтвердил супрессивный эффект эндоморфинов на выброс NO мышиными перитонеальными макрофагами in vivo, данный эффект полностью блокировался введением β-FNA. Однако in vitro при добавлении ЭМ-1 и ЭМ-2 в культуры перитонеальных макрофагов не было зарегистрировано никаких модулирующих эффектов в отношении радикалов NO [57].

При анализе влияния ЭМ-1 на созревание и функциональную активность дендритных клеток было установлено, что ЭМ-1 снижает экспрессию CD80, CD86, CD83, HLA-DR и CCR7 на активированных дендритных клетках и угнетает секрецию ими IL-12 и IL-10. При совместном культивировании Т-лимфоцитов и дендритных клеток с обработкой ЭM-1 пролиферация Т-клеток нарушалась, и в культуральном супернатанте определялись меньшие количества IL-12 и IFN-γ [58]. В то же время ЭМ-1 налоксон-зависимо усиливает экспрессию поверхностных молекул дендритных клеток периферической крови CD86, CCR7 и CD36, индуцированных гипергликемией, но замедляет созревание дендритных клеток на фоне гипергликемии. Помимо этого, ЭМ-1 ингибирует индуцированную гипергликемией экспрессию молекулы TLR4 на поверхности дендритных клеток [59].

Есть данные, что ЭМ-1 (10-10–10-16М), но не ЭМ-2 in vitro усиливает репликацию ВИЧ в клетках микроглии человека. Интересно, что данный эффект блокируется β-FNA или токсином коклюша, однако классические лиганды DAMGO и морфин не оказывали подобного действия [60].

Некоторые иммуномодулирующие свойства эндоморфинов освещены в серии работ, посвященных изучению атеросклероза. Ключевыми клетками в развитии этого процесса выступают макрофаги, а ключевой молекулой принято считать молекулу CD36, экспрессирующуюся на их поверхности, так как через нее опосредуется поступление в клетку окисленных форм липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и формирование так называемых пенистых клеток (макрофагов, нагруженных ЛПНП). В некоторых статьях есть данные о провоспалительной активности опиоидных пептидов, в частности ЭМ-1, при атеросклерозе. Так, с помощью методов флуоресцентной и конфокальной микроскопии показано, что пептид снижает концентрацию липидных включений в макрофагах линии TH1 в концентрациях 10-6–10-8 М. Методом проточной цитометрии зарегистрировано статистически значимое снижение экспрессии СD36 TH1 макрофагами в культурах с ЭМ-1 [49].

На эндотелиоцитах пуповинной вены (HUVEC) показано, что в физиологических концентрациях (от 100 nM до 10 μМ) эндоморфины оказывали стимулирующее влияние на пролиферацию, миграцию и адгезивные свойства эндотелиоцитов, а в высоких концентрациях (50, 100 μМ) был зарегистрирован токсический эффект пептидов на клеточную линию HUVEC. При этом эффект блокировался налоксоном, что говорит о реализации действия эндоморфинов через опиатные рецепторы [61].

Необходимо отметить, что в ряде работ представлены данные, свидетельствующие об отсутствии у эндоморфинов иммуномодулирующей активности. Так, в статье Carrigan и соавт. (2000) подтвержден обезболивающий эффект ЭМ-1 на крысах, но при этом не обнаружена какая-либо иммуномодулирующая активность. Авторы оценивали активность NK-клеток селезенки, продукцию IFN-γ, пролиферативный ответ лимфоцитов после стимуляции конканавалином А (Кон A), ЛПС и микробным суперантигеном TSST (токсин синдрома токсического шока). Было показано, что интрацеребровентрикулярная инъекция ЭМ-1 в левый латеральный желудочек приводила к существенной антиноцицепции, отменяемой налтрексоном, но не влияла на изучаемые иммуннологические параметры. Авторы предположили, что ЭМ-1 при данной схеме введения мог не диффундировать в области мозга, ответственные за иммуномодуляцию [62, 63]. Другим объяснением возможного отсутствия у ЭМ-1 иммунномодулирующих эффектов может быть несоответствие доз, необходимых для анальгезии и иммуномодуляции (табл.).

Таблица. Иммуномодулирующие эффекты эндоморфинов

Примечание: THP-1 – клеточная линия моноцитарной лейкемии человека; Caco-2 – клеточная линия аденокарциномы толстого отдела кишечника; HL-60 – клеточная линия промиелоцитарного лейкоза человека.

Таким образом, эндоморфины модулируют функции клеток врожденного и адаптивного иммунитета, оказывая эффекты как угнетающей, так и стимулирующей направленности. Так, реакции адаптивного иммунитета эндоморфинами подавляются, в то время как реакции врожденного иммунитета могут как угнетаться, так и стимулироваться. Направленность эффектов сильно зависит от объекта исследования, исследуемых доз и концентраций, условий активации клеток и используемой модели эксперимента. Этим эндоморфины отличаются от своего низкомолекулярного аналога – морфина, который оказывает выраженное угнетающее действие на функции клеток врожденного и адаптивного иммунитета, подавляя фагоцитоз, пролиферацию, продукцию цитокинов, усиливая апоптоз и смещая поляризацию Т-хелперов в сторону Th2-клеток [64]. Проявляя модулирующее действие, эндоморфины, скорее, более близки к β-эндорфину, который, несмотря на смешанный спектр связывания (μ,δ), является преимущественно μ-агонистом и, в зависимости от условий, может оказывать как стимулирующее, так и угнетающее действие на широкий спектр иммунных реакций in vivo и in vitro. Эффекты β-эндорфина (особенно in vitro) налоксоном не устраняются, а могут даже потенцироваться [65]. Аналогичную картину мы можем наблюдать и у эндоморфинов, когда не все их эффекты отменяются антагонистами, а наиболее выраженный антагонистический эффект оказывает β-FNA, но не налоксон, хорошо известный как антагонист морфина. Из всех групп опиоидных пептидов, способных связываться с μ-OP, пожалуй, только у энкефалинов стимулирующие эффекты преобладают над супрессорными [66]. Соотношение иммуномодулирующих эффектов по направленности между группами эндогенных опиоидных пептидов можно отобразить следующим образом (рис. 2).

Рисунок 2. Соотношение стимулирующих и угнетающих эффектов между группами эндогенных опиоидных пептидов: (+) – стимуляция, (-) – угнетение.

На наш взгляд, подобные феномены могут зависеть от двух основных причин. Первая заключается в структуре μ-OP, лиганд-связывающий карман которого большой и глубокий, очень похожий на CXCR4 (хемокиновый рецептор), однако намного глубже. Помимо этого, в отличие от мускаринового рецептора лиганд-связывающий карман μ-OP ничем не защищен, что создает структурную основу для очень быстрой кинетики диссоциации агонистов и антагонистов. Также рецептор способен связывать агонисты, выраженно отличающиеся по физико-химическим свойствам, низкомолекулярные (морфин, его производные, налоксон, β-FNA и т.д.) и значительно более крупные агонисты пептидной природы [67]. Другой причиной может являться способность короткоцепочечных пептидов проникать внутрь клетки через мембрану путем транслокации или эндоцитоза, без связывания со специфическим рецептором [68], что, в свою очередь, приводит к активации различных цепочек внутриклеточных мессенджеров и, соответственно, различному эффекту [69]. Хотя эндоморфины обладают низкой способностью к эндоцитозу [19], вероятность такого механизма нельзя исключить вследствие их короткоцепочечной структуры. Значительно усиливается способность эндоморфинов к эндоцитозу после химической модификации – путем метилирования, гликозилирования или липидирования, что может иметь важное клиническое значение [70].

Подводя итог, можно сказать, что на сегодняшний день эндоморфины являются перспективными агентами, способными эффективно регулировать ноцицептивные сигналы, в том числе при воспалительных процессах различной этиологии, а также модулировать функциональную активность клеток иммунной системы. Эксперименты по химической модификации эндоморфинов дают возможность в перспективе получить мощные фармакологические агенты, действующие через опиоидные рецепторы без формирования побочных эффектов опиатов, таких как толерантность и зависимость. Возможность разделить анальгетические эффекты эндоморфинов и их способность модулировать иммунный ответ является перспективным направлением дальнейших исследований.

Источники финансирования. Поисково-аналитическая работа по подготовке рукописи проведена в рамках государственного задания, номер государственной регистрации темы № АААА-А19-119112290007-7.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи, о которых следует сообщить.

Участие авторов: Гейн С.В. – анализ полученных данных, написание текста; Баева Т.А. – сбор и обработка материалов. Оба автора внесли существенный вклад в проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации.