problendoПроблемы ЭндокринологииProblems of Endocrinology0375-96602308-1430Endocrinology Research Centre10.14341/probl19994563-6problendo-10675Research ArticleКлиническая эндокринологияClinical endocrinologyИммунологические подходы к предикции инсулинзависимого сахарного диабетаImmunological approaches to the prediction of insulin-dependent diabetes mellitusЗвереваЯ. С.ZverevaYa. S.probl@endojournals.ruДубинкинИ. В.DubinkinI. V.probl@endojournals.ruЗиловА. В.ZilovA. V.probl@endojournals.ruТакласН.TaklasN.probl@endojournals.ruАлексеевЛ. П.AlekseevL. P.probl@endojournals.ru<p>Государственный научный центр "Институт иммунологии" Минздрава РФ, Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова</p>Россия<p>State Scientific Center "Institute of Immunology" of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow Medical Academy I. M. Sechenova</p>Russian Federation199915121999456ТОМ 45, №6 (1999)36Copyright &#x00A9; Зверева Я.С., Дубинкин И.В., Зилов А.В., Таклас Н., Алексеев Л.П., 19991999Зверева Я.С., Дубинкин И.В., Зилов А.В., Таклас Н., Алексеев Л.П.Zvereva Y.S., Dubinkin I.V., Zilov A.V., Taklas N., Alekseev L.P.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.probl-endojournals.ru/jour/article/view/10675

Обследовано 150 больных с различными нарушениями углеводного обмена: инсулинзависимым сахарным диабетом — ИЗСД (58 больных), нарушением толерантности к легкоусвояемым углеводам (14), инсулиннезависимым сахарным диабетом (11); группа риска (сибсы) состояла из 67 обследуемых, здоровых доноров было 50 человек.

Исследовали ряд подходов к определению аутоантител к островковым клеткам (ICA) поджелудочной железы. Применяли 2 метода исследования: реакцию непрямой иммунофлюоресценции с использованием криосрезов поджелудочной железы человека, иммуноферментный метод с использованием наборов фирмы "Biomerica"под торговой маркой ”Isletest". Показано, что выявляемость ICA у больных ИЗСД с длительностью заболевания до 2 лет на криосрезах поджелудочной железы человека составила 66,7%, в "Isletest" — 50%. Имеется общая тенденция к снижению выявляемости ICA с увеличением длительности заболевания. Полученные двумя методами результаты неконкордантны. Аутоантитела к инсулину при этой патологии найдены в 37,5% случаев, что свидетельствует о необходимости комплексного подхода к иммунодиагностике доклинических стадий ИЗСД.

 

 

A total of 150 patients with carbohydrate metabolism disorders were examined: 58 with insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM), 14 with impaired tolerance of easily assimilable carbohydrates, 67 subjects at risk of these conditions (sibs), 11 patients with non-insulin-dependent diabetes mellitus (NIDDM), and 50 donors. Autoantibodies to pancreatic islet cells (ISA) were tested by two methods: indirect immunofluorescence with cryosections of human pancreas and enzyme immunoassay with the Isletest kits (Biomerica). In IDDM patients with the disease duration of up to 2 years, ISA were detected in 66.7% cases on cryosections of human pancreas and in 50% cases by the Isletest. There was a general tendency to a lower rate of ISA detection with a longer duration of the disease. The results of the two methods did not agree. Autoantibodies to insulin (IAA) were detected in 37.5%) of these patients, which indicates the need in a comprehensive approach to immunodiagnosis of the preclinical stages of IDDM.

сахарный диабетнарушение углеводного обменаиммунологический подходdiabetes mellitusviolation of carbohydrate metabolismimmunological approach

Известно, что в основе патогенеза инсулинзависимого сахарного диабета (ИЗСД) лежит аутоиммунная деструкция бета-клеток поджелудочной железы [1]. Дальнейшее изучение ИЗСД показало, что продромальной стадии данного заболевания соответствует период постепенно развивающегося аутоиммунного воспаления островков (инсулина) и деструкции инсулинпродуцирующих бета-клеток, не сопровождающийся в течение длительного времени клиническими признаками ИЗСД [2].

В 1975 г. G. Botazzo и соавт. впервые выявили у больных ИЗСД циркулирующие аутоантитела к цитоплазматическим антигенам островковых клеток (1СА) [9|, а N. Maclaren и S. Huang — аутоантитела к поверхностным антигенам островковых клеток |5|. Palmer в 1983 г. обнаружил в сыворотке больных с впервые выявленным ИЗСД аутоантитела к инсулину (IAA). Описаны случаи выявления ICA и IAA за 8 лет и более до появления клинических признаков ИЗСД [10]. Таким образом, по определению циркулирующих специфических аутоантител у пациентов появилась возможность реально предсказывать развитие клинических признаков ИЗСД. В большинстве случаев у лиц с ИЗСД выявляются аутоантитела к бета-клеткам островков Лангерганса поджелудочной железы (ICA) и аутоантитела к инсулину (IAA) [6]. У больных с впервые выявленным ИЗСД ICA встречаются в 70% случаев [6], IAA — в 20—50% [12]. У пациентов с наличием ICA наблюдается прогрессивное снижение функциональной активности бета-клеток, что проявляется в нарушении ранней фазы секреции инсулина [4]. При деструкции 80% инсулинпродуцирующих клеток появляются клинические признаки ИЗСД.

Для определения аутоантител наиболее часто используют метод иммунофлюоресценции и иммуноферментный анализ. Разработаны методы обнаружения в сыворотке больных циркулирующих аутоантител к антигенам островковых клеток с использованием срезов поджелудочной железы или культуры островковых клеток человека или грызунов [9, 11]. Референс-методом определения 1САдо сих пор остается метод иммунофлюоресцентного окрашивания криосрезов поджелудочной железы человека 1(0) группы крови, однако данный метод трудоемок и плохо поддается стандартизации [7]. В последние годы были идентифицированы конкретные молекулы бета-клеток, в отношении которых развивается аутоиммунный ответ и появляются аутоантитела при ИЗСД. Это прежде всего глутаматдекарбоксилаза [6] или антиген с мол. массой 64 кД — р64, а также тирозинфосфатаза — IA-2 (ICA-512) и инсулин [8]. Иммуноферментный метод определения аутоантител к этим структурам бета-клеток поджелудочной железы имеет ряд преимуществ перед иммунофлюоресцентным методом на криосрезах, так как менее трудоемок, более чувствителен и легко стандартизуем. В настоящее время появились коммерческие наборы ряда фирм (’’Biomerica”, "1MMC0 Diagnostics” и др.) для определения циркулирующих аутоантител к островковым клеткам.

Выявление доклинической стадии ИЗСД позволит остановить или отсрочить развитие явного ИЗСД с нарушением показателей углеводного обмена [3]. Проблема изучения ранних стадий заболевания представляется актуальной в связи с возможностью активного воздействия на механизмы, способствующие развитию сахарного диабета.

Цель нашего исследования заключалась в изучении эффективности ряда подходов к определению аутоантител к островковым клеткам поджелудочной железы в клинической практике у больных с различными нарушениями углеводного обмена: ИЗСД, инсулиннезависимым сахарным диабетом (ИНСД), нарушением толерантности к легкоусвояемым углеводам, а также в группе риска различными методами.

Материалы и методы

Обследовано 150 больных в возрасте от 10 до 60 лет с длительностью заболевания от 1 мес до 15 лет. ИЗСД отмечен у 58 больных (в том числе у 24 впервые выявлен), ИНСД — у И, группа риска состояла из 67 сибсов, нарушение толерантности к легкоусвояемым углеводам наблюдалось у 14 пациентов. Контрольную группу составили 50 здоровых доноров.

Для определения аутоантител к цитоплазматическим структурам бета-клеток (ICA) в сыворотках крови пациентов и здоровых доноров использовали вариант реакции непрямой иммунофлюоресценции с использованием криосрезов поджелудочной железы донора с неотягощенным эндокринологическим анамнезом в возрасте 45 лет, группа крови I (0). Кусочки ткани замораживали в жидком азоте. С помощью криотома ’’LEITZ” на предметных стеклах готовили криосрезы толщиной 3 мкм с последующей фиксацией в ацетоне при 4°С (2 мин). Срезы служили в качестве антигена для тестирования исследуемых сывороток на присутствие специфических аутоантител. Исследуемые сыворотки больных разводили в соотношении 1 : 10, 1 : 20, 1 : 40 в физиологическом растворе, забуференном фосфатами pH 7,2 (PBS), и инкубировали во влажной камере с соответствующими разведениями сывороток 1 ч при комнатной температуре. Срезы 5 раз промывали PBS и наносили FITC-меченную антисыворотку кролика против иммуноглобулинов G человека (RaH-FITC) ”Dako”. Инкубировали во влажной камере 30 мин при комнатной температуре, 5 раз промывали PBS, заключали в смесь глицерин: PBS (1 : 1) и накрывали покровными стеклами. Учет реакции иммунофлюоресценции проводили с помощью флюоресцентного микроскопа Axioskop ("Opton”). В качестве отрицательного контроля реакции использовали сыворотку крови здорового донора, не содержащую аутоантител, в качестве положительного контроля — сыворотку, содержащую 1СА у больного с впервые выявленным ИЗСД. Параллельно определяли ICA и IAA иммуноферментным методом с использованием наборов фирмы "Biomerica” под торговой маркой ’’Isletest” в соответствии с прилагаемой инструкцией.

Результаты и их обсуждение

Результаты исследования уровня ICA в сыворотках пациентов с различными вариантами нарушений углеводного обмена, а также улиц группы риска представлены в табл. 1.

Как видно из данных, приведеных в табл. 1, определение ICA на криосрезах у 150 больных с помощью иммунофлюоресцентного метода показало высокую выявляемость в группах больных с ИЗСД с длительностью заболевания до 2 лет и более 2 лет: ICA выявлены в 67 и 62% случаев соответственно, а в группе лиц с нарушением толерантности к углеводам — в 35,7% случаев. В группе риска 1СА выявлены в 19,4% случаев, в группе доноров ICA не определялись. У больных с первичным диагнозом ИНСД ICA выявлены в 9% случаев. ’’Isletest” использовали при обследовании этих же больных. В результате обследования максимальная частота выявляемости ICA зафиксирована в группе лиц с ИЗСД длительностью до 2 лет (50) и более 2 лет (37%). Более низкий уровень выявляемости ICA отмечен у пациентов с нарушением толерантности к легкоусвояемым углеводам (28,6%), больных ИНСД (18%), сибсов (10%), здоровых доноров (4%) (см. табл. 1). При выявлении аутоантител к инсулину (IAA) максимальная частота выявления (46%) зарегистрирована в группе больных ИЗСД с длительностью заболевания до 2 лет; при длительности заболевания более 2 лет IAA выявлены в 35% случаев, при нарушении толерантности к легкоусвояемым углеводам — в 14%, при ИНСД — в 9%, в группе риска — в 22,5%, в группе здоровых доноров — в 2% случаев (см. табл. 1).

Полученные результаты подтверждают высокую специфичность ICA и IAA для больных ИЗСД (особенно при впервые выявленном заболевании). Кроме того, имеется общая тенденция к уменьшению частоты выявления ICA обоими методами с

Таблица 1

Выявляемость ICA и IAA у больных с различными нарушениями углеводного обмена

—---------------------------------------- ДиагнозРеакция непрямой иммунофлюоресценцииИммуноферментный метод
ICA на криосре зах"Isletest"
положительные ICAположительные ICAположительные IAA
абс.%абс.%абс.%
ИЗСД длительностью до 2 лет (п = 24)1666,71250И46
ИЗСД длительностью более 2 лет (л = 34)2161,81337*1235
Нарушение толерантности к легкоусвояемым углеводам (/7 = 14)535,7428,6214
ИНСД (/7 = 11)1921819
Группа риска (сибсы) (л = 67)1319,47101522,5
Здоровые доноры (л = 50)002412

* Для больных ИЗСД длительностью более 2 лет выявляемость ICA первым методом (на криосрсзах) значимо выше (61,8%), чем вторым методом "Isletest" (37%) (р < 0,05).Выявляемость ICA и IAA у больных ИЗСД в завимости от длительности заболевания

Длительность заболевания, годыICA на криосрезах"Isletest"
1САIAA
положительные 1САчастота выявления признака, %положительные 1САчастота выявления признака, %положительные ICAчастота выявления признака, %
       
Менсе 1 (п = 24)1666,7*1041,6937,5
1—5 лет
(« = 16)1062,5729531,2
Более 5
(п = 28)1135,7*937,5725

* Для больных ИЗСД с длительностью заболевания менее 1 года выявляемость ICA на криосрезах составила 66,7%, более 5 лет — 35,7% (р < 0,05).

Таблица 3

Выявляемость ICA и IAA у больных ИЗСД в различных возрас тных группах

ICA на криосрезах"Isletest"
Возраст больных, годыICAIAA
положительные 1САчастота выявления признака, %положительные 1САчастота выявления признака, %положительные IAAчастота выявления признака, %
       
Младше 16 (/? = 10)10100*440440
16—40 лет
(и = 27)1866,71244933,3
Старше 40
(и = 21)940*И52,3628,5

* Наблюдается достоверно значимое различие в выявляемости ICA у больных ИЗСД для 2 возрастных групп — младше 16 лет (100%) и старше 40 лет (40%) (р < 0,05).

увеличением длительности заболевания. С увеличением возраста пациентов отмечена тенденция к увеличению выявляемости ICA в "Isletest” (хотя различие недостоверно из-за ограниченности выборки). Выявляемость же 1СА на криосрезах с помощью иммунофлюоресцентного метода при увеличении возраста пациентов достоверно уменьшается (табл. 2, 3).

Частота выявления IAA также снижается с увеличением длительности ИЗСД и возраста пациента (см. табл. 2, 3). Различий в выявляемости аутоантител у больных ИЗСД в зависимости от пола не обнаружено (рис. 1).

Метод определения ICA на криосрезах поджелудочной железы человека показал достаточно высокую специфичность у больных с ИЗСД длительностью до 2 лет (67%).

По данным литературы [9] и согласно инструкции, специфичность "Isletest" позволяет выявить до 75% лиц с дебютом ИЗСД. Однако при определении ICA этим методом в нашем исследовании только в 50% случаев получены положительные результаты у больных с впервые выявленным ИЗСД. Нами обнаружена неконкордантность групп больных, выявленных двумя методами определения ICA. Она была характерна для всех групп исследуемых пациентов. При ИЗСД длительностью до 2 лет выявляемость ICA при суммировании результатов обоих способов определения достигает 100%, более 2 лет — 79,4% (рис. 2). Таким образом, одновременное определение ICA двумя описанными методами позволяет увеличить чувствительность определения ранних стадий ИЗСД.

Вместе с тем клинический диагноз ИЗСД не может базироваться исключительно на результатах иммунодиагностики, а должен опираться также на совокупность клинических, анамнестических и генетических факторов. Дальнейшее применение методов определения ICA и IAA позволит разработать скрининговые программы для тестирования групп лиц с повышенным риском развития ИЗСД, прежде всего в семьях, где болен один из родителей или детей. Эффективная доклиническая диагностика ИЗСД имеет большое практическое значение и необходима для своевременного начала наблюдения за пациентами и принятия ряда терапевтических мер с целью превенции или отсрочки клинической манифестации ИЗСД при относительно сохранной функции бета-клеток.

Рис. 1. Зависимость уровня выявляемости (в %) ICA от пола больных ИЗСД.

/ — длительность ИЗСД до 2 лет; 2— длительность ИЗСД более 2 лет. а — лица мужского пола; б — лица женского пола.

Рис. 2. Зависимость уровня выявляемости (в %) ICA от метода исследования.

/ — ИЗСД (длительность до 2 лет); 2 — ИЗСД (длительность более 2 лет); 3 — нарушение толерантности к легкоусвояемым углеводам; 4 — ИНСД; 5 — группа риска (сибсы).

а — 1СА на криосрезах; б — 1CA в Isletest"; в — ICA на криосрезах и ICA в "Isletest" одновременно; г — ICA на криосрезах или ICA в "Isletest".Выводы

ReferencesВельбри С. К. // Иммунологическая диагностика заболеваний поджелудочной железы. — М.. 1985. — С. 134.Вельбри С. К. // Иммунологическая диагностика заболеваний поджелудочной железы. — М.. 1985. — С. 134.Полторак В. В., Бриндак О. И., Ладогубец Е. В. // Проблемы эндокринол. — 1986. — № 3. — С. 81—87.Полторак В. В., Бриндак О. И., Ладогубец Е. В. // Проблемы эндокринол. — 1986. — № 3. — С. 81—87.Шалънев Б. И., Петросова В. Н., Сускова В. С. // Мед. генетика и иммунология. — 1988. — № 2. — С. 1—72.Шалънев Б. И., Петросова В. Н., Сускова В. С. // Мед. генетика и иммунология. — 1988. — № 2. — С. 1—72.Argulla Е., Stender Е. // Immunology of Islet Cells — Diabetic Pancreas. — New York, 1985. P. 493—512.Argulla Е., Stender Е. // Immunology of Islet Cells — Diabetic Pancreas. — New York, 1985. P. 493—512.Atkinson M. A., Maclaren N. K., Reley W. J. et al. // Diabetes. — 1986. Vol. 35. P. 894.Atkinson M. A., Maclaren N. K., Reley W. J. et al. // Diabetes. — 1986. Vol. 35. P. 894.Baekkeskov S., Aanstoot H. J., Christgau S. // Nature. — 1990. — Vol. 347. P. 151-156.Baekkeskov S., Aanstoot H. J., Christgau S. // Nature. — 1990. — Vol. 347. P. 151-156.Boitard C., Bonifatio С. E., Botazzo G. F. et al. // Diabetologia. 1988. Vol. 31. P. 451-452.Boitard C., Bonifatio С. E., Botazzo G. F. et al. // Diabetologia. 1988. Vol. 31. P. 451-452.Bonifacio E., Wilkin T., Palmer J. et al. // Ibid. — 1987. — Vol. 30. P. 676.Bonifacio E., Wilkin T., Palmer J. et al. // Ibid. — 1987. — Vol. 30. P. 676.Botazzo G. E, Florin-Christensen A., Doniach D. // Lancet. — 1974. Vol. 2. P. 1279-1282.Botazzo G. E, Florin-Christensen A., Doniach D. // Lancet. — 1974. Vol. 2. P. 1279-1282.Botazzo G. E, Gliechmann H. // Diabetologia. — 1986. — Vol. 29. P. 125.Botazzo G. E, Gliechmann H. // Diabetologia. — 1986. — Vol. 29. P. 125.Karlsen A. E., Miharelsen В. K., Pedersen J. K. // Diabet. Nutr. Metab. 1992. Vol. 5, Suppl. 1. P. 151-154.Karlsen A. E., Miharelsen В. K., Pedersen J. K. // Diabet. Nutr. Metab. 1992. Vol. 5, Suppl. 1. P. 151-154.Roll U., Ziegler A. G. // Exp. clin. Endocrinol. Diabetes. — 1997. Vol. 105. P. 1-14.Roll U., Ziegler A. G. // Exp. clin. Endocrinol. Diabetes. — 1997. Vol. 105. P. 1-14.Soeldner J. S., Tuttleman M., Eisenbarth G. S. et al. // New Engl. J. Med. 1985. Vol. 313. P. 893-900.Soeldner J. S., Tuttleman M., Eisenbarth G. S. et al. // New Engl. J. Med. 1985. Vol. 313. P. 893-900.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.