В 1956 г. D. Adams и Н. Purves впервые обнаружили в сыворотке пациентов с болезнью Грейвса- Базедова (БГБ, диффузный токсический зоб) фактор, который стимулировал щитовидную железу, однако отличался по структуре от тиреотропного гормона (ТТГ). Суть их опыта состояла в том, что введение сыворотки пациентов с БГБ морским свинкам приводило к увеличению захвата радиоактивного йода щитовидной железой. Длительность действия обнаруженного фактора была больше, чем у ТТГ, в связи с чем он был назван LATS (англ. Long-acting thyroid stimulator — длительно действующий стимулятор щитовидной железы) [2]. J. McKenzie модифицировал этот опыт, предложив использовать мышей [43]. LATS начал рассматриваться как причина тиреотоксикоза при БГБ, а "метод McKenzie" определения LATS оставался методом выбора до начала 70-х годов XX века.

В 1964 г. выяснилось, что LATS относится к фракции IgG [35, 44]. Позднее LATS станет известен как TSI (англ. Thyroid stimulating immunoglobulins — иммуноглобулины, стимулирующие щитовидную железу) и TSAb (англ. Thyroid stimulating antibodies — антитела, стимулирующие щитовидную железу). Кроме того, оказалось, что LATS может быть адсорбирован экстрактом человеческой тиреоидной ткани [35]. Данное наблюдение позволило модернизировать "метод McKenzie", обладавший сравнительно низкой чувствительностью, и в дальнейшем разработать так называемый метод "LATS-protector" [3]. Этот метод компенсировал использование гетерологичного человеческого иммуноглобулина в опытах на мышах. В начале 70-х годов было показано, что сыворотка с LATS-npo- тектором стимулирует функцию щитовидной железы человека in vitro [65] и in vivo [4]. В последнем исследовании D. Adams и соавт. сами себе вводили сыворотку от пациентов с БГБ, предварительно приняв внутрь радиоактивный йод.

В 1966 г. на мембране тироцита был обнаружен рецептор ТТГ (рТТГ) [55] и с этого момента началось его интенсивное изучение. В 1970 г. исследования показали, что LATS имитирует действие ТТГ, активируя аденилатциклазу, связанную с его рецептором [26, 37]. В 1973 г. Т. Опауа и соавт. инкубировали тонкие срезы человеческой щитовидной железы с сыворотками от пациентов с БГБ и оценивали формирование внутриклеточных коллоидных капель и накопление цАМФ [51]. Это измерение цАМФ в тироцитах заложило основу для сегодняшних биологических методов in vitro, использующих культуры клеток щитовидной железы для обнаружения антител к рТТГ.

Применение срезов щитовидной железы человека стало одним из существенных недостатков метода, поэтому в 1976 г. вместо них было предложено использовать монослойные культуры тироцитов [58]. Человеческие тироциты сохраняли при низкой температуре, а затем инкубировали в бессолевой среде, что позволило значительно увеличить чувствительность метода [22, 27, 59, 72]. С помощью данной методики было показано, что динамика TSI может являться критерием эффективности лечения БГБ [1]. Позднее метод упростили, использовав свиные тироциты и преципитацию антител на полиэтиленгликоле [28], но метод оставался недостаточно чувствительным.

Более успешным стало применение для определения TSAb культивированной линии тироцитов крысы (FRTL-5) [6, 74]. Исследования TSAb с помощью FRTL-5 обладали большей чувствительностью, чем ТВ1-исследования [29].

В то же время оказалось, что антитела, связывающиеся с рТТГ, могут не только стимулировать активность щитовидной железы, но и блокировать ее. В сыворотке некоторых пациентов с БГБ были обнаружены антитела, которые ингибировали активацию аденилатциклазной системы ТТГ [12, 24, 41, 52]. Эти антитела были названы ТВАЬ или TSBAb (англ. TSH stimulation blocking antibodies — антитела, блокирующие ТТГ-стимуляцию).

В 1974 г. В. Rees Smith и R. Hall [61], а также S. Manley и соавт. [40] независимо друг от друга продемонстрировали, что TSAb конкурируют с ТТГ за связывание с его рецептором на мембранах тироцитов. Позднее В. Rees Smith и R. Hall описали ра- диорецепторный метод, основанный на конкурентном ингибировании связывания ТТГ, меченного 1251, с рТТГ [62]. Благодаря своей относительной простоте данный метод — TBI (англ. TSH-binding inhibition — ингибирование связывания ТТГ) — был впоследствии принят множеством специалистов, а антитела, обнаруженные этим методом, были обозначены как ТВП (англ. TSH-binding inhibitory immunoglobulins — иммуноглобулины, ингибирующие связывание ТТГ). Дальнейшие модификации и экономическая целесообразность сделали на сегодняшний день это исследование методом выбора для определения антител к рТТГ в большинстве клинических лабораторий.

В начале 80-х годов несколько исследователей обнаружили существование особой группы антител к рТТГ — TGAb (англ. — thyroid growth antibodies — антител, стимулирующих рост щитовидной железы) [И, 79]. Однако сейчас большинство ученых относят TGAb к группе TSAb [60].

В настоящее время все антитела, имеющие сродство к рТТГ, принято обозначать как TRAb (англ. — thyroid receptor antibodies — антитела к рТТГ). Существует несколько вариантов классификаций TRAb, однако наиболее простой и логичной выглядит классификация, в которой выделяют только 2 группы антител к рТТГ [60]: TSAb — антитела, стимулирующие щитовидную железу; TSBAb — антитела, блокирующие ТТГ-стимуля- цию щитовидной железы.

Данная классификация основана на влиянии, которое оказывают антитела на рТТГ и щитовидную железу в целом. TSAb стимулируют рТТГ, запуская аденилатциклазную (активируется адени- латциклаза) и инозитолфосфатную (активируется фосфолипаза А2) системы [10]. Продукция цАМФ увеличивается, далее повышается поглощение йода и синтез тиреоглобулина — так запускается механизм развития тиреотоксикоза. Одновременно происходит увеличение объема щитовидной железы. Выработка TSAb является причиной возникновения БГБ. TSBAb связываются с рТТГ, однако не оказывают при этом стимулирующего действия. Результатом этого является нарушение взаимодействия ТТГ со своим рецептором. Таким образом, в тироцитах снижается выработка цАМФ. Образование TSBAb является причиной развития некоторых случаев гипотиреоза. Существование других групп антител (TGAb, нейтральные антитела) окончательно не доказано и требует дальнейшего изучения.

Выделение группы TBII (иммуноглобулинов, ингибирующих связывание ТТГ) связано с использованием метода TBI. Данный метод выявляет антитела к рТТГ независимо от их функционального действия, поэтому в качестве ТВП могут выступать и TSAb, и TSBAb, и сумма этих антител.

Современные методики определения антител к рТТГ

На сегодняшний день определение антител к рТТГ проводят двумя принципиально различными способами (см. таблицу).

Вышеупомянутая клеточная линия тироцитов крысы (FRTL-5) содержит крысиный рТТГ, гетерологичный для человека. Именно это стало при-

Методы определения антител к рТТГ

Выделяе-

чиной разработки новой клеточной линии СНО (англ. — Chinese hamster ovary — яичник китайского хомячка), экспрессирующей рекомбинантный человеческий рТТГ [39, 46, 75]. Считается, что среди биологических методов применение клеточных линий СНО обладает наибольшими перспективами для использования в клинической практике [20, 53, 63]. Метод основан на количественном определении содержания цАМФ с помощью РИА в ответ на взаимодействие с антителами к рТТГ. Он позволяет дифференцировать TSAb и ТВАЬ. По чувствительности метод значительно превосходит как биологические методы с использованием FRTL-5 [31, 75], так и TBI-тесты 1-го поколения [13, 25, 48, 75]. Данный метод достаточно трудоемкий и занимает много времени, однако он считается "золотым стандартом" для исследования антител к рТТГ [60].

С целью упростить проведение исследования в генотип клеточных линий СНО был встроен ген цАМФ-зависимого фермента люциферазы. Увеличение аденилатциклазной активности клетки в результате взаимодействия с клеткой TSAb приводит к активизации люциферазы и образованию люциферина, обладающего свойством люминесциро- вать. Таким образом, содержание цАМФ возможно определить с помощью люминометра [14, 78].

Определенный интерес вызывают исследования, изучавшие эпитопы взаимодействия рТТГ с самим ТТГ, TSAb и ТВАЬ. Для этого были получены клетки-химеры СНО, в которых определенные участки человеческого рТТГ были заменены на гомологичные участки рецептора ЛГ/ХГ (лютеинизирующий гормон/хорионический гонадотропин). В результате выделено 2 клона химер: Мс1 + 2 (заменены аминокислотные участки 8—165) и Мс2 (заменены аминокислотные участки 90—165). Проведенные исследования показали, что взаимодействие TSAb с обыкновенным человеческим рТТГ (WT — wild type TSH-R) происходит преимущественно в области N-конца (участки 30—165), а ТТГ и ТВАЬ — в области С-конца [5, 21, 34, 50, 67]. При использовании химер Мс1 + 2 и Мс2 активность TSAb снижается в отличие от ТТГ и ТВАЬ, активность которых сохраняется [32, 33, 68] (рис. 1). Однако, помимо главного эпитопа связывания TSAb, существуют "минорные" эпитопы, расположенные за пределами N-конца, благодаря которым TSAb распознается химерами Мс1 + 2 и Мс2 в 13—22% сывороток пациентов с БГБ [32]. Наличие эпитопной гетерогенности TSAb может служить прогностическим критерием течения БГБ (см. далее). Эпитопная гетерогенность обнаружена и для ТВАЬ [18].

Тем не менее в большинстве клинических лабораторий наиболее широко используются ТВ I-тесты в силу своей простоты и сопоставимой информативности. Радиорецепторный метод TBI требует использования 2 основных компонентов: рецептора ТТГ и самого ТТГ, меченного 12Т. В связи с тем что определенная часть антител к рТТГ является видоспецифичной, использование в системе человеческого рТТГ наиболее предпочтительно для исследования.

Ткань человеческой щитовидной железы труднодоступна, поэтому в качестве альтернативы ранее применяли растворенный свиной рТТГ [19, 62, 66]. В качестве 1251-меченного лиганда лучше всего подошел очищенный бычий ТТГ, который обладает большей биологической активностью, чем человеческий ТТГ. Относительно низкая стоимость (по сравнению с биологическими методами) сделала TBI-тесты 1-го поколения широко распространенными в клинической практике, но они обладают рядом недостатков: не дифференцируются TSAb и ТВАЬ; используется гетерологичный рТТГ (свиной); чувствительность меньше, чем у биологических методов [13, 25, 29, 48, 80]; результаты недостаточно коррелируют с активностью TSAb и данными клиники [20].

По данным различных исследований, около 10% пациентов с клинически явной БГБ имели отрицательные результаты при определении антител к рТТГ с помощью TBI-тестов 1-го поколения [23, 30]. Возможной причиной было использование гетерологичного свиного рТТГ, поэтому уже в конце 80-х годов появились первые работы, посвященные разработке клеточных линий СНО, экспрессирующих человеческий рТТГ, и их возможному применению для определения антител к рТТГ [38, 49, 54, 57]. Были разработаны линии клеток СНО, продуцирующие различное количество рецепторов к ТТГ: ~2 • 106 рецепторов на 1 клетку для TBI-тестов с использованием растворенных рецепторов и -16- 103 рецепторов на 1 клетку для TBI-тестов с использованием цельных клеток [8, 16, 25].

В 1999 г. начали применять TBI-тесты 2-го поколения: западногерманская фирма "В. R. А. Н. М. S. Diagnostica" выпустила радиорецепторную тест-систему "DYNOtest TRAKhuman" (рис. 2). В данной технологии используют человеческий рТТГ (экспрессируемый клеточной линией К562 leukemia), моноклональные антитела и специальные цилиндры из полистирола (coated tubes). Моноклональные антитела выстилают цилиндры, с их помощью фиксируются рецепторы ТТГ. Моноклональные антитела не препятствуют связыванию рТТГ ни с ТТГ, ни с ТВП [9]. TBI-тесты 2-го поколения существуют в двух вариантах: бычий ТТГ метят либо радиоактивным 12Ч, либо хемилюминесцентным эфиром акридина. Преимущества TBI-тестов 2-го поколения следующее: используется человеческий рТТГ; чувствительность выше, чем у ТВ1-тестов

го поколения [9, 17, 64, 79], и практически такая же, как у биологических методов [42]; специфичность приближается к 100% [9, 17, 64].

Исследование антител к рТТГ используют в клинической практике для решения 2 задач: проведения дифференциальной диагностики между БГБ и другими заболеваниями, протекающими с синдромом тиреотоксикоза (прежде всего функциональной автономией щитовидной железы) и оценки вероятности развития рецидива/ремиссии у пациентов с БГБ, получающих длительную терапию тиреостатиками.

Антитела к рТТГ специфичны для БГБ. На момент диагноза ТВП можно обнаружить у 75—96% больных (с помощью TBI-тестов 1-го поколения), а TSAb — у 85—100%. Среди здорового населения их регистрируют в 1—2% случаев [9, 69]. TBI-тесты 2-го поколения определяют ТВП более, чем у 98% пациентов с БГБ [9, 42]. О наличии антител к рТТГ при других заболеваниях щитовидной железы в литературе имеются достаточно противоречивые данные. Так, при аутоиммунном тиреоидите (АИТ) антитела к рТТГ определяли в 6% [71] и 60% случаев [7].

Наиболее актуальной клинической проблемой является дифференциальная диагностика болезни Грейвса и функциональной автономии (ФА) щитовидной железы, которая в йоддефицитных регионах не уступает по распространенности БГБ в ряду заболеваний, протекающих со стойким тиреотоксикозом [36]. Подходы же к лечению этих двух заболеваний принципиально различаются — эффективность от длительной (18—24 мес) консервативной тиреостатической терапии можно ожидать только в отдельных группах пациентов с болезнью Грейвса и никогда при ФА. При ФА щитовидной железы антитела к рТТГ практически всегда отсутствуют. В настоящее время для проведения дифференциальной диагностики между ФА и БГБ наиболее целесообразно использовать TBI-тесты 2-го поколения.

Wallaschofski и соавт. изучали сыворотки 21 пациента с диагнозом многоузлового токсического зоба (МТЗ), у которых с помощью TBI-тестов 1-го поколения не были выявлены ТВП. При исследовании уровня ТВП с помощью TBI-тестов 2-го поколения и уровня TSAb с помощью клеточной линии СНО (JP 26) было показано, что 11 (52%) из 21 пробы оказались TSAb-положительными, 10 из этих 11 проб к тому же оказались ТВП-положи- тельными, а 1 имела пограничный результат. Авторы сделали заключение о том, что эти 11 пациентов, несмотря на наличие многоузлового зоба, имели БГБ [77].

Pedersen и соавт. обследовали больных с впервые выявленным тиреотоксикозом. 106 пациентам был поставлен диагноз БГБ, 94 — МТЗ. Антитела к рТТГ оценивали с помощью TBI-тестов 1-го и 2-го поколения. Среди больных с исходно поставленным диагнозом БГБ ТВП были выявлены у 67,9% (TBI-тесты 1-го поколения) и 95,3% (ТВ1-тесты

го поколения). Среди больных с диагнозом МТЗ ТВП были выявлены у 9% (TBI-тесты 1-го поколения) и 17% (TBI-тесты 2-го поколения). В группах больных с МТЗ с наличием или отсутствием ТВП по результатам TBI-тестов 2-го поколения объем щитовидной железы и число узлов по данным УЗИ не различались. Наличие ТВП у значительной части больных с МТЗ (17%) авторы объясняют возможным развитием БГБ на фоне предсуществую- щего многоузлового зоба [56].

Meller и соавт. провели ретроспективное исследование, в которое включили 32 пациента с диагнозом диссеминированной ФА (вариант ФА, при котором в щитовидной железе отсутствуют "горячие" узлы, а гиперпродукция тиреоидных гормонов осуществляется рассосредоточенными по всей железе автономными тироцитами) на основании обнаружения у них манифестного/субклинического тиреотоксикоза, отрицательных результатов TBI- тестов 1-го поколения и отсутствия эндокринной офтальмопатии. 5 больных получили хирургическое лечение до повторного исследования и 1 больной — после; 4 пациента прошли курс терапии радиоактивным йодом, 10 больных принимали ти- реостатики, а 13 оставшимся лечение не проводили. На момент повторного исследования антител к рТТГ у 12 пациентов был эутиреоз, у 12 — субклинический тиреотоксикоз, а у 8 — манифестный. В результате с помощью TBI-тестов 2-го поколения у 7 (22%) из 32 больных были выявлены ТВП, что позволило авторам сделать вывод о наличии у этих больных БГБ, а не ФА [45].

Результаты приведенных выше исследований свидетельствуют, во-первых, о том, что дифференциальная диагностика БГБ и ФА, которая базируется только на клинических данных (наличие или отсутствие узловых образований и/или эндокринной офтальмопатии и др.), обладает недостаточной чувствительностью по сравнению с обследованием, включающим в себя оценку уровня ТВП, а во-вторых, о большей чувствительности TBI-тестов 2-го поколения.

Определение антител к рТТГ может использоваться для оценки вероятности развития рецидива/ ремиссии у пациентов с БГБ, получающих терапию тиреостатиками. Теоретически в качестве прогностического критерия могут выступать уровень антител перед началом лечения, изменения уровня антител в процессе антитиреоидной терапии или наличие антител в конце лечения. Согласно мнению большинства исследователей, уровни ТВП и TSAb перед началом антитиреоидной терапии плохо коррелируют с частотой рецидивов после окончания лечения [42, 47, 53, 63, 73].

Тем не менее Р. Vitti и соавт. показали, что частота рецидивов после антитиреоидной терапии зависит от уровня антител к рТТГ на момент постановки диагноза, а также от возраста и размера зоба. Исследовали сыворотки 306 пациентов с БГБ, принимавших тиреостатики. У 194 (63,4%) из них в течение 3 лет после окончания лечения развился рецидив заболевания. Рецидивы наблюдались у 40 (85%) из 47 больных с высоким уровнем ТВП (> 30 Ед/л) и у 54 (53%) из 101 больного с низким уровнем ТВП (< 30 Ед/л). Ремиссия чаще наблюдалась у пациентов с низким уровнем ТВП (< 30 Ед/л) и меньшим объемом щитовидной железы (< 40 мл), чем у пациентов с высоким уровнем ТВП (> 30 Ед/л) и большим объемом щитовидной железы (> 40 мл) — в 43,3 и 9% случаев соответственно. В группе больных старше 40 лет с низким уровнем ТВП (< 30 Ед/л) и объемом щитовидной железы < 40 мл частота ремиссии достигала 80% [76].

Исследование эпитопов взаимодействия TSAb с рТТГ также может использоваться для прогноза перед началом лечения и во время него. W. Kim и соавт. показали, что пациенты с эпитопной гетерогенностью TSAb достигают эутиреоидного состояния быстрее и при использовании меньших доз ти- реостатиков по сравнению с больными, у которых вырабатываются TSAb, связывающиеся лишь с главным эпитопом рТТГ [32, 33].

Для оценки вероятности развития рецидива/ре- миссии проводятся исследования, анализирующие динамику уровня антител к рТТГ у пациентов, получающих терапию тиреостатиками. V. Michelange- li и соавт. изучали сыворотки 85 пациентов с БГБ, которым был назначен курс антитиреоидных препаратов. Средняя продолжительность лечения составила 18 мес (12—20 мес), средняя продолжительность наблюдения после окончания лечения — 30 мес (15 мес—5 лет). Критерием стойкой ремиссии заболевания было эутиреоидное состояние на протяжении как минимум 15 мес. Уровни ТВП и TSAb оценивали перед началом лечения, через 6, 12 и 18 мес после его начала. Из 85 пациентов только 39 (46%) достигли стойкой ремиссии, а у 46 (54%) развился рецидив. Средние первоначальные уровни ТВП и TSAb в группе пациентов с рецидивом (для ТВП — 40 Ед/л в диапазоне от 4 до 77 Ед/л) были заметно выше, чем средние уровни ТВП и TSAb перед началом лечения в группе пациентов, достигших ремиссии (для ТВП — 56 Ед/л в диапазоне от 8 до 90 Ед/л). Однако только у 19 (68%) из 29 пациентов с первоначальным уровнем ТВП > 60 Ед/л развился рецидив. Авторы отмечают важную особенность динамики уровня антител к рТТГ в процессе лечения: у пациентов, достигших стойкой ремиссии, уровни ТВП и TSAb неуклонно снижались на протяжении как минимум 12 мес, тогда как у больных с возникшим рецидивом с 6-го по 12-й месяц лечения уровни антител практически не изменялись. Если уровень ТВП снижался до контрольной отметки в течение первых 12 мес терапии, то вероятность достижения стойкой ремиссии составляла 73% [47].

Вместе с тем наиболее значимым считается определение антител к рТТГ в конце лечения. Считается, что наличие антител к рТТГ после окончания антитиреоидной терапии несет почти 90% риск развития рецидива в течение последующих 3 лет. Однако у оставшихся 10% пациентов рецидив не развивается. Отсутствие антител к рТТГ в конце лечения имеет небольшую прогностическую ценность, поскольку болезнь рецидивирует у 25—40% таких пациентов [15, 53, 63, 73, 76].

Внедрение в клиническую практику высокочувствительных TBI-тестов 2-го поколения, судя по всему, существенно не увеличило точность прогноза. Так, D. Maugendre и С. Massart с помощью TBI- тестов 2-го поколения проводили исследование сывороток 140 пациентов с впервые выявленной БГБ. На момент постановки диагноза ТВП были выявлены у 138 (98,6%) из 140 пациентов. После проведения 18-месячного курса лечения тиреостатиками ТВП были обнаружены у 48 (34%) из 140 больных. В течение 3 лет после окончания лечения рецидив развился у 60 (43%) пациентов и соответственно 80 (57%) пациентов достигли стойкой ремиссии. Среди пациентов с рецидивом на момент окончания лечения ТВП регистрировались у 36 (60%) из 60 больных, а среди пациентов, достигших

летней ремиссии, — лишь у 12 (15%) из 80. У 92 пациентов после окончания лечения ТВП не выявлялись, однако у 24 (26%) из них развился рецидив [42].

Т. Zimmermann-Belsing и соавт. изучали сыворотки 129 пациентов с впервые выявленной БГБ, прошедших курс терапии тиреостатиками. После окончания лечения с помощью TBI-тестов 2-го поколения сыворотки исследовали на наличие ТВП. В течение 2 лет рецидив заболевания наблюдался у 58 пациентов. При использовании точки разделения, равной 1,5 МЕ/л, выявление ТВП несло 55% риск развития рецидива, а при использовании точки разделения 1 МЕ/л — 49% риск. У лиц, не имевших ТВП в диагностическом титре после окончания антитиреоидной терапии, рецидив развивался в 62 и 60% случаев соответственно [80].

Радиорецепторный метод TBI в силу своей простоты, относительно низкой стоимости и сопоставимой с биологическими методами информативности в клинической практике является наиболее предпочтительным для определения антител к рТТГ.

ТВ 1-тесты 2-го поколения обладают большей чувствительностью, чем TBI-тесты 1-го поколения, и почти 100% специфичностью.

Дифференциальная диагностика БГБ и ФА щитовидной железы должна проводиться с учетом уровня ТВП, определенного с помощью TBI-тестов 2-го поколения.

На сегодняшний день в литературе имеются противоречивые данные в отношении определения уровня антител к рТТГ с целью оценки вероятности развития ремиссии/рецидива БГБ после терапии тиреостатиками. Поскольку прогностическая ценность выявления антител к рТТГ в диагностическом титре окончательно не определена, результаты данного теста надо интерпретировать в совокупности с результатами других диагностических методов.