Обследовано 109 больных СД с длительностью заболевания до 1 года в фазе декомпенсации, из них 36 больных СД1 и 33 — медленно прогрессирующим аутоиммунным СД взрослых (LADA). В качестве контроля обследовано 40 больных СД типа 2 (СД2) с длительностью заболевания до 1 года и 15 здоровых доноров (табл. 1).

Оценку иммунного статуса проводили на проточном цитометре FACSCalibur с использованием моноклональных антител ("Becton Dickinson") к дифференцировочным антигенам лимфоцитов периферической крови по стандартной методике. При этом оценивали процентные и количественные показатели Т-клеточной популяции (CD3+, CD4+, CD8+), естественных клеток-киллеров (CD16+), В-клеточной популяции (CD19+) лимфоцитов, а также процентное содержание лимфоидных клеток, несущих маркеры активации (HLA- DR-антиген, CD38) и маркерный антиген апоптоза (CD95).

Типирование 3 локусов HLA 2-го класса (DRB1, DQA1, DQB1) осуществляли с использованием наборов НПФ ЗАО "ДНК-технология" по прилагаемому протоколу.

Количественное определение ИЛ проводили методом иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием коммерческих наборов "Cytelisa" для определения ИЛ 1, 2, 4 и набора "Biosourse International" для определения ИЛ-8.

Аутоантитела к цитоплазматическим антигенам [3-клеток (ICA) и глутаматдекарбоксилазе (GAD) определяли методом непрямого иммуноферментного анализа с использованием наборов "Isletest ICA" фирмы "Biomedica", аутоантитела к инсулину

Таблица 1. Основные клинические характеристики больных (М ± т)

(LAA) — методом непрямого иммуноферментного анализа ("ELISA test" фирмы "Mercodia"). Для оценки функции [3-клеток определяли уровень С- пептида натощак иммуноферментным методом с использованием наборов DSL (США). Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием программы Excel и Statistica v 6.0.

В обследуемых группах диагноз СД1 и СД2 ставили на основании этиологической классификации [19], диагноз LADA — на основании критериев, предложенных Р. Zimmet [20]:

Как выяснилось в последние годы, группа больных LADA является гетерогенной [13, 17].

Наличие высоких титров аутоантител к GAD65 позволяет идентифицировать подгруппу больных LADA-1 с клиническими характеристиками, близкими к СД1, и более ранним развитием инсулино- потребности по сравнению с другой подгруппой — LADA-2, характеризующейся низкими титрами GAD65 и клиническими критериями СД2.

У больных LADA-1 повышен риск развития других аутоиммунных заболеваний, в том числе тиреоидита Хашимото, болезни Аддисона. Некоторые авторы расценивают этот подтип как компонент аутоиммунного полиэндокринного синдрома [И].

По результатам определения уровня аутоантител группу больных LADA разделили на 2 подгруппы — LADA-1 и LADA-2 (рис. 1, 2).

К группе LADA-2 были отнесены больные с низким титром антител к GAD (5,0 ± 0,14 Ед/мл) и отсутствием других групп антител, к группе LADA-1 —

Рис. 2. Содержание ICA (в Ед/мл).

GAD анти-

больные с высоким титром антител к (14,0 ± 1,8 Ед/мл) и наличием комбинации тел к GAD и островковым клеткам. При этом титр антител к GAD и ICA был значительно ниже у больных LADA-1 по сравнению с больными СД1 (р < 0,05 и р < 0,001 соответственно).

Сравнительно низкие титры антител к антигенам островковых клеток у больных LADA, вероятно, обусловливают менее агрессивное течение аутоиммунного процесса, развитие потребности в экзогенном инсулине через несколько лет от начала заболевания и как следствие выявление LADA на поздней стадии [4] (табл. 2).

Предрасположенность к СД1 генетически детерминирована. Наибольшее значение из известных генетически маркеров СД1 имеют гены области HLA на хромосоме 6р21.3 (IDDM1). Высокий риск развития СД1 определяют аллельные варианты генов HLA: DRBl*03*04; DQAl*0501*0301; DQBl*0201*0302 [8, 10]. По результатам генетического исследования у больных LADA (независимо от принадлежности к LADA-1 или LADA-2) чаще других определялись отдельные аллели DQAl*501 и DQB 1*201, а также сочетания с протективными аллелями DQB 1*0602-8.

Несмотря на выявление при LADA генотипов HLA-системы, свидетельствующих о высоком риске развития СД, некоторые авторы придают им меньшее значение, чем при СД1 [16, 18]. При этом низкие титры антител к GAD у пациентов пожилого возраста при остутствии генотипов высокого риска и других типов антител к островковым клеткам, по данным ряда авторов, не могут свидетельствовать о прогрессирующем снижении функциональной активности р-клеток [9, 12].

Таблица 2. Клинические характеристики выделенных подгрупп LADA (М± т)

Таблица 3. Распределение HLA DR-DQ-аллелей

Разница гаплотипов LADA и СД1 ввиду небольшого объема выборки статистически недостоверна (табл. 3).

У всех больных отмечается дисбаланс про- и противовоспалительных цитокинов (рис. 3, 4).

Для цитокинов характерен сложный сетевой характер функционирования, при котором продукция одного из них влияет на образование или проявление активности ряда других. ИЛ, являющиеся подгруппой цитокинов, не способны самостоятельно индуцировать специфический иммунный ответ; они его регулируют. Воспалительные процессы регулируются провоспалительными ИЛ 1, 6, 8, 12 и противовоспалительными ИЛ 4, 10, специфические иммунологические реакции — ИЛ 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 12 [3].

В исследуемых группах больных СД 1 и LADA по сравнению с контрольной группой здоровых доноров отмечается достоверное повышение уровня триггеров воспалительного ответа ИЛ-10 (р < 0,01), хемоаттрактанта ИЛ-8 (р < 0,01). ИЛ-1, вызывая повреждение структуры ДНК и приводя к снижению ее содержания в клетке, ускоряет наступление гибели клетки. ИЛ-8 является индуктором острой воспалительной реакции, стимулирует адгезивные свойства нейтрофилов. Повышение уровня ИЛ-8 может свидетельствовать о развитии нарушения микроциркуляции уже в начальных стадиях СД.

В то же время наблюдаются тенденция к снижению уровня ИЛ-2 при СД1 и LADA-1 (/? > 0,05) и достоверное его снижение при LADA-2 и СД2 (/-’ < 0,01).

Цитокины Thl-типа активируют реакции клеточного иммунитета, т. е. цитотоксические и воспалительные реакции, опосредованные Т-клетка- ми, естественными киллерами и макрофагами. Усиление реакций с участием цитокинов Thl-типа приводит к возникновению органоспецифических аутоиммунных заболеваний, развитие которых обусловлено чрезвычайно высокой степенью защищенности организма от воздействия вредных экзогенных внутриклеточных факторов.

Цитокины Тй2-типа активируют реакции гуморального иммунитета, т. е. продукцию антител В- клетками, особенно реакции, опосредованные через IgE, усиление пролиферации и функционирования эозинофилов: их чрезмерная активность приводит к развитию атопических заболеваний [3].

В исследуемых группах отмечается снижение содержания противовоспалительного цитокина ИЛ-4, относящегося к Т112-клеткам, при СД1 (р < 0,01) и LADA-1 (р < 0,01). При LADA-2 наблюдается инверсия ИЛ-4 (р < 0,05), сопровождающая медленное прогрессирование заболевания.

Выделяя разные наборы цитокинов, Thl - и Th2- клетки не только стимулируют различные эффекторные механизмы иммунного ответа, но и взаимно подавляют иммунорегуляторную активность друг друга.

Не обнаружено значимых изменений со стороны NK-клеток (CD 16), В-клеток (CD 19), а также Т-хелперов (CD4) и Т-супрессоров (CD8) и их соотношения в исследуемых группах (р > 0,05) (рис. 5).

Отмечено нарастание процентного содержания активированных лимфоидных клеток (CD38), более выраженное при СД1 и обеих подгруппах LADA (р > 0,05), что свидетельствует о напряженности иммунной системы (рис. 6).

При исследовании содержания Fas-рецептора апоптоза (CD95) (см. рис. 6) обнаружена тенденция к его снижению при СД1 (р > 0,05) и более выраженная тенденция к повышению при СД2 (Р > 0,05).

Апоптоз является физиологическим процессом, генетически детерминированным рецепторопосре- дованным механизмом самоуничтожения клеток. Поскольку эндокринный аппарат поджелудочной железы активно ремоделируется в постнатальном периоде жизни, апоптоз фактически заново включает синтез белка [1]. По какому пути произойдет клеточная гибель — некроза или апоптоза, во многом зависит от клеточного содержания АТФ и Са2+. При дефиците АТФ не хватает энергии для реализации двух энергоемких процессов: деградации и распада ядра и перестройки клеточной мембраны с выходом на наружную поверхность аннексин-V- распознаваемого фосфатидилсерина, и тогда нарушение целостности клеточной мембраны приводит к утилизации клетки в процессе некроза [2, 7].

Снижение показателя Fas-рецептора апоптоза (CD95) при впервые выявленном СД1, вероятно, свидетельствует о дефиците внутриклеточной АТФ, преобладании интенсивности аутоиммунного процесса и некротической гибели клеток.

При LADA аутоиммунный процесс развивается постепенно; образования АТФ и, вероятно, сохраненного функционирования митохондрий достаточно для завершения апоптотической программы [3-клеток.