Изучена роль β-эндорфина на фоне блокады опиатных рецепторов и селективных агонистов μ- и δ-рецепторов DAMGO и DADLE на реакцию бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) и продукцию IL-1β), γ-IFN и IL-4 в присутствии фито-гемагглютинина (ФГА). Установлено, что β-эндорфин, налоксон и селективные μ- и δ-агонисты стимулировали ФГА-ин-дуцированную РБТЛ, не влияя на спонтанный пролиферативный ответ. На фоне блокады опиатных рецепторов эффект β-эндорфина не отменялся, а напротив, усиливался, так как налоксон оказывал самостоятельное стимулирующее действие на РБТЛ. В условиях предварительной обработки апиоидами в течение 1 ч влияния на пролиферативный ответ не зарегистрировано, β-эндорфин, налоксон и DADLE усиливали ФГА-индуцированную продукцию IL-4. Налоксон оказывал разнонаправленное влияние на синтез этого цитокина, угнетая его в спонтанном варианте. На продукцию IL-1β) и γ-IFN опиоидные пептиды и налоксон влияния не оказывали. Высказано предположение о том, что β-эндорфин, налоксон и селективные μ- и δ-агонисты способствуют дифференцировке Т-лимфоцитов в сторону Тh2-клеток.
The authors studied a role of β-endorphin during the blockade of opiate receptors and selective μ- and δ-receptor agonists DAMGO and DADLE to the reaction of lymphocytic blast-cell transformation (RLBCT) and to the production of IL-1β, γ-IFN, and IL-4 in the presence of phytohemagglutinin (PHA). It was found that β-endorphin, naloxone, and the selective μ- and δ-receptor agonists stimulated PHA-induced RLBCT, without affecting a spontaneous proliferative response. During opiate receptor blockade, the effect of β-endorphin was not abolished, but, on the contrary, enhanced as naloxone exerted a stimulating effect on RLBCT. A proliferative response was not recorded during preliminary one-hour opioid treatment, β-endorphin, naloxone, and DADLW enhanced the PHA-induced production of IL-4. Naloxone exerted a heterodirectional effect on the synthesis of this cytokine, by inhibiting it spontaneously. The opioid peptides and naloxone produced no effect on the production of IL-1β) and γ-IFN. It is suggested that β-endorphin, naloxone, and the selective μ- and δ-receptor agonists promote the differentiation of Т lymphocytes towards Th2-cells.
Поддержание внутреннего гомеостаза определяется взаимодействием трех основных систем организма: нервной, эндокринной и иммунной. В настоящее время известно, что иммунная система многокомпонентна и ее функционирование обеспечивается сложной сетью взаимосвязанных сигналов. Эндогенные опиоидные пептиды являются одними из важнейших посредников во взаимодействии нервной и иммунной систем, кроме этого, они представляют собой группу факторов, играющих ключевую роль в процессах адаптации организма [8, 14]. Несмотря на то что изучению влияния эндогенных опиоидных пептидов на процессы пролиферации уделено достаточно много внимания [1,2, 11], вопрос о механизмах реализации эффектов опиоидов, в частности р-эндорфина, способного действовать через несколько типов опиатных рецепторов, остается актуальным. Также недостаточно изученной остается проблема влияния опиоидных пептидов на продукцию ряда ключевых цитокинов (у- IFN, IL-4, IL-10, 1L-12), являющихся маркерными для регуляторных Т-лимфоцитов 1-го и 2-го типа (ТМ/Тп2) и определяющих выбор типа иммунного ответа [4, 12, 13]. Цель работы - оценка влияния p-эндорфина на фоне блокады опиатных рецепторов и селективных 5- и р- агонистов на пролиферативный ответ лимфоцитов in vitro и установка взаимосвязи пролиферативных процессов с продукцией IL-lp, y-IFN и IL-4.
Объектом исследования служили лейкоциты периферической венозной крови здоровых мужчин-добровольцев в возрасте 22—30 лет. Лейкоциты культивировали с фитогемагглютинином Р — ФГА ("Sigma"; конечная концентрация в культуре составляла 2,5 мкг/мл) в 96-луноч- ных круглодонных планшетах. Каждая культура содержала 2* 105 клеток в 0,2 мл полной питательной среды, которую готовили на основе среды 199 с добавлением 10 мм HEPES ("Sigma"), 2 мМ L-глутамина ("Sigma"), 100 мкг/мл гентамицина и 10% аугоплазмы. Культивирование осуществляли во влажной атмосфере с 5% СО2 при 37*С в течение 72 ч. За 18 ч до окончания культивирования в каждую лунку вносили по 2 мкКи 3Н-метил- тимидина ("Изотоп", Санкт-Петербург) в объеме 10 мкл. Радиоактивность проб определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике "Guardian" ("Wallac", Финляндия).
В эксперименте использовали р-эндорфин ("Sigma") в концентрации 10“7 М; ц-агонист DAMGO (]d-Ala2, N- Me-Phe4, С1у5-о1]-энкефалин; "Sigma") - Ю~* M; 5-агонист DADLE ([d-Ala2, d-LeUjl-энкефалин; "Sigma") - 10“7 M; налоксона гидрохлорид ("DuPont", CILIA) - 10-6 M. Выбор концентрации опиоидов и ФГА основывался на исследованиях, проведенных ранее [
Концентрацию IL-ip, IL-4 и y-IFN определяли при одномоментном внесении опиоидов и ФГА в супернатантах 48-часовых культур параллельно оценке пролиферативной активности. Применяли метод ELISA с использованием наборов "РгоСоп" ("Протеиновый контур", Санкт-Петербург). Определение проводили в соответствии со стандартной методикой, предложенной производителем.
Все полученные в работе данные представлены в виде средней и ее стандартной ошибки (Л/ ± т). Использовали корреляционный, факторный анализ для парных данных с p-эндорфином и налоксоном в качестве факторов и парный t-критерий для межгруппового сравнения.
Результаты и их обсуждение
Анализ влияния p-эндорфина на фоне блокады опиатных рецепторов налоксоном гидрохлоридом показал наличие статистически значимого самостоятельного влияния как p-эндорфина (F = 7,53; р = 0,025), так и налоксона (F = 9,27; р = 0,016) на пролиферацию лимфоцитов в присутствии ФГА. Статистически значимого воздействия между собой (F = 0,439; р = 0,526) Р-эндорфин и налоксон не проявили. Оценка направленности их эффектов показала (рис. 1) стимулирующее влияние р- эндорфина на выраженность реакции бласттрансформа- ции лимфоцитов (РБТЛ) по сравнению с контрольными культурами. Блокада опиатных рецепторов налоксоном не отменяла стимулирующего эффекта Р-эндорфина а напротив, приводила к статистически достоверному усилению пролиферации по сравнению как с контролем так и с эффектом одного Р-эндорфина. Аналогичное р’-эн- дорфину влияние на выраженность пролиферативного ответа оказывали налоксон, а также селективные ц и 5- агонисты В культуре без митогена статистически досто верных эффектов исследуемых опиоидовне выявлено
Не было зарегистрировано ответа на включение 3Н- тимидина при предварительной обработке^течение 1 4 Х^™вГьЗ^ИИиг™орфино“'нмоксон™"™' же селективными ц- и 8-агонистами как в стимулирован- ных ФГА, так и в нестимулироинных культур^Црис 2).
Оценку уровня IL-ip, y-IFN и IL-4 проводили параллельно определению пролиферативной активности с целью исследования взаимосвязи между пролиферативными процессами и направлением дифференцировки Т- лимфоцитов (Thl/Th2). Как видно из таблицы, уровень y-IFN в супернатантах под воздействием Р-эндорфина, его комбинации с налоксоном и селективных ц- и 8-агонистов не отличался от контроля как в спонтанных, так и в стимулированных ФГА культурах. Анализ влияния р- эндорфина и налоксона на ФГА-индуцированную продукцию IL-4 показал их статистически достоверное взаимодействие (F = 36,5; р < 0,0003). p-Эндорфин значительно активировал синтез 1L-4. Аналогичный р-эндор- фину эффект давал налоксон. В то же время при одновременном внесении в культуру p-эндорфина и налоксона усиления продукции IL-4 по сравнению с контролем не зарегистрировано. Активирующее влияние на синтез IL-4 в присутствии ФГА оказывал 5-агонист DADLE. При анализе влияния опиоидов на спонтанную продукцию IL-4 был выявлен статистически значимый эффект налоксона (F = 6,61; р < 0,05). Антагонист опиатных рецепторов угнетал синтез этого цитокина по сравнению с контрольными культурами. p-Эндорфин, его комбинация с налоксоном, а также селективные агонисты ц- и 8- рецепторов в нестимулированных митогеном культурах влияния на уровень IL-4 не оказывали. Анализ продукции IL-ip показал отсутствие влияния исследуемых опиоидов на этот показатель как в спонтанных, так и в стимулированных ФГА образцах.
Проведенный корреляционный анализ выявил статистически достоверную отрицательную зависимость между интенсивностью пролиферации и уровнем IL-4 в культурах с совместным внесением p-эндорфина и налоксона в присутствии ФГА (г = -0,68; р < 0,05).
Ранее в литературе уже была описана возможность как супрессивного, так и активирующего влияния р-эн- дорфина на выраженность РБТЛ преимущественно в присутствии низких концентраций митогена [1, 2]. Отсутствие влияния Р-эндорфина, налоксона и селективных ц- и 8-агонистов на спонтанную пролиферативную активность может служить свидетельством того, что опиоидные пептиды являются важными факторами регуляции уже активированных иммунокомпетентных клеток.
Стимулирующая направленность влияния р-эндор- фина, налоксона и селективных агонистов 8- и ц-опиат- ных рецепторов на РБТЛ, на наш взгляд, опосредована прежде всего системой IL-1, поскольку этот цитокин играет ключевую роль в запуске иммунного ответа как in vivo, так и in vitro. Показано, что Р-эндорфин способен стимулировать синтез IL-ip [
Известно, что Р-эндорфин способен усиливать синтез 1L-4 СО4+-лимфоцитами [
Ранее было показано отсутствие отмены влияния р- эндорфина на пролиферативный ответ на фоне блокады опиатных рецепторов [
Сравнительный анализ действия p-эндорфина и селективных агонистов 8- и ц-рецепторов пептидной природы не показал существенной разницы в выраженности и направленности их влияния как на РБТЛ, так и на ФГА-индуцированную продукцию IL-ip, y-IFN и IL-4.
Таким образом, полученные в настоящей работе данные указывают на то, что опиоидергическая регуляция пролиферации и дифференцировки иммунокомпетентных клеток является сложным многофакторным процессом, в котором как агонисты, так и антагонисты опиатных рецепторов способны давать самостоятельные модулирующие эффекты.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.