Опыты выполнены на белых беспородных крысах обоего пола массой 180—220 г. Всех животных содержали на обычном рационе и перед опытом лишали пищи в течение 18—24 ч без ограничения в воде. Гипогликемическую кому (содержание глюкозы в крови около 1 ммоль/л) вызывали внутримышечной инъекцией инсулина в дозе 40 ЕД на 1 кг массы, купирование проводили введением коматозным животным 3 мл 40% раствора глюкозы в желудок. Подопытные животные перенесли 5—7 гипогликемических ком с интервалом 2 дня. Исследовали ткани больших полушарий и ствола мозга интактных животных (контроль) и крыс, дека- питированных на 2-е сутки после 5—7-й гипогликемической комы.

Цитоплазматическую и митохондриальную фракции отделов мозга получали путем дифференциального центрифугирования [1]. Интенсивность гликолиза в цитоплазматической фракции определяли по скорости накопления лактата в инкубационной среде, используя в качестве субстратов глюкозу и глюкозо-6-фосфат [8]. Активность НАД-изоцитратдегидрогеназы (НАД-ИЦДГ, НФ 1.1.1.41),     НАДФ-изоцитратдегидрогеназы

(НАДФ-ИЦДГ, НФ 1.1.1.42), НАД-малатдегид- рогеназы (НАД-МДГ, НФ 1.1.1.37), НАДФ-ма- латдегидрогеназы (НАДФ-МДГ, НФ 1.1.1.40), глутаматдегидрогеназы (ГДГ, НФ 1.4.1.2), лактатдегидрогеназы (ЛДГ, НФ 1.1.1.27), глюкозо-6-фос- фатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ, НФ 1.1.1.49) и глутатионредуктазы (ГР, НФ 1.6.4.2) оценивали спектрофотометрически [5]. Скорость НАДН-дегидро- геназной реакции (НАДН-ДГ, НФ 1.6.99.3.) определяли с дихлорфенолиндофенолом [19]. Активность супероксиддисмутазы (СОД) оценивали по торможению восстановления нитросинего тетразо- лия [2].

При изучении общей АТФазной активности обработку ткани и процедуру определения проводили, как описано в работе [12]. 5'-Нуклеотидазную активность (НФ 3.1.3.5) исследовали, внося в инкубационную среду АМФ в количествах, эквимолярных АТФ. Аденозинмонофосфатдезаминазную (АМФД, НФ 3.5.4.6) активность оценивали по накоплению аммиака. Среда инкубации включала 0,005 М калий-фосфатный буфер pH 7,6, 10 мМ АМФ, 5 мМ АТФ и 0,1—0,2 мг белка цитоплазматической или митохондриальной фракции. Пробы инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Реакцию останавливали охлаждением проб до 0°С, белки осаждали ТХУ с последующим центрифугированием. К 0,05—0,2 мл супернатанта добавляли 5 мл безаммиачной воды, 0,1 мл реактива Несслера и регистрировали изменение оптической плотности при 400 нм в течение 15 с [3].

Таблица 1

Активность дегцдрогеназ (в нмоль/мин на 1 мг белка) и СОД (в ЕД на 1 иг белка) в мозге крыс, перенесших серию гипогликемических ком (X ± А,)

Примечание. Здесь и в табл. 2 и 3 число опытов в каждой серии 5—6; звездочкой обозначены статистически достоверные по сравнению с контролем изменения — р < 0,05.

Интенсивность цитолиза исследовали по накоплению ЛДГ в среде инкубации [16]. Срезы больших полушарий мозга толщиной 0,35—0,40 мм готовили по описанию, приведенному в работе [17], и помещали в среду Кребса—Рингера следующего состава (в мМ): 132 NaCl, 5 КС1, 1,2 NaH2PO4, 1,3 MgCl2, 1,2 СаС12, 10 глюкозы, pH 7,4. Предынкуба- цию срезов проводили при 37°С в течение 2 ч, затем срезы переносили в среду того же состава с уменьшенной вдвое концентрацией NaCl и инкубировали в течение 2 ч. В дальнейшем вносили в гипотоническую среду Fe2+ и аскорбат в конечных кон

центрациях соответственно 10-5 и 2 • 10-4 М и продолжали инкубацию еще в течение 2 ч. По окончании опыта срезы гомогенизировали и оценивали в них уровень малонового диальдегида (МДА) [7].

Количество белка определяли по Лоури. Результаты экспериментов обрабатывали статистически с применением /-критерия Стьюдента.

У крыс, перенесших серию гипогликемических ком, не выявлено изменений активности НАД-за- висимых дегидрогеназ в больших полушариях (табл. 1). При этом в них обнаружено уменьшение активности Г-6-ФДГ и ГР соответственно на 7 и 12%. В стволе мозга наблюдали увеличение активности НАД-ИЦДГ на 20% и снижение активности митохондриальных НАДФ-ИЦДГ и НАД-МДГ соответственно на 37 и 9%, а также снижение активности НАДН-ДГ на 15%. Активность СОД уменьшается в больших полушариях и в стволе мозга подопытных животных соответственно на 51 и 39% (см. табл. 1).

АТФазная активность, определяемая в митохондриальной фракции, не изменяется, а в цитоплазматической фракции, полученной из больших полушарий и ствола мозга, увеличивается соответственно на 16 и 31%, активность АМФД в исследованных отделах мозга увеличивается в цитоплазматической фракции на 30—46%, в митохондриальной фракции — на 20—27%; активность 5'-нуклео- тидазы не изменялась (табл. 2).

Накопление ЛДГ в процессе предынкубации срезов мозга подопытных и контрольных животных в изотонической среде было одинаковым. Обнаружено увеличение выхода ЛДГ в гипотоническую среду из срезов мозга крыс, перенесших серию гипогликемических ком, по сравнению с интактными животными на 7%; р < 0,05 (контроль 74,4 ± 1,1, опыт 79,8 ± 1,7 мкмоль в 1 мин на 1 мг белка). Еще большей (18%; р < 0,05) оказалась разница в выходе ЛДГ из срезов мозга контрольных животных и крыс, неоднократно перенесших гипогликемию, при добавлении в среду Fe2+ и аскорбата (контроль 44,1 ± 2,3, опыт 52,1 + 3,5 мкмоль/мин на 1 мг белка). Уровень МДА в срезах мозга подопытных животных в конце инкубации оказался на 47% (р < 0,05) выше, чем у интактных животных: контроль 0,85 ± 0,06, опыт 1,12 ± 0,07 нмоль на 1 мг белка.

Глюкоза является главным энергетическим субстратом в мозге, основной путь ее использования — гликолиз, потокоформирующим ферментом которого в нервной ткани служит гексокиназа [6]. Изменений интенсивности гликолиза при использовании в качестве субстратов глюкозы и глюкозо-6- фосфата у крыс, неоднократно перенесших гипогликемию, не выявлено (табл. 3). Не обнаружено также изменений интенсивности гликолиза в состоянии собственно гипогликемической комы и в ранние сроки купирования однократной гипогликемической комы [9]. Полученные результаты согласуются с представлениями о том, что основным фактором, лимитирующим потребление глюкозы головным мозгом, в целом является не столько активность ферментов гликолиза, сколько скорость поступления глюкозы из крови к нейронам при изменении уровня гликемии [6, 13, 14].

Гипогликемическая кома является энергодефицитным состоянием и сопровождается нарушением ионных градиентов 113, 14], восстановление которых требует работы АТФаз. Na+-, К+-АТФаза плазматических мембран клеток мозга могут потреблять до 40% всей АТФ, образуемой в нервной ткани, и после фракционирования определяется преимущественно в цитоплазматической фракции [20], поэтому заманчиво предположить, что выявленные в настоящем эксперименте изменения активности АТФ, обнаруживаемые в цитоплазматической фракции, связаны с Na+-, К+-АТФазой.

Увеличение потребления АТФ неизбежно приводит к нарастанию уровня АМФ в мозге, что может способствовать распаду АМФ в дальнейшем [13]. Катаболизм АМФ осуществляется двумя путями — дезаминированием АМФ и его дефосфорилированием. При этом дезаминирование АМФ в АМФ-дезаминазной реакции является одним из механизмов поддержания энергетического заряда клетки. Отсутствие изменений активности 5'-нук- леотидазы и увеличение активности АМФД (см. табл. 2) свидетельствуют о том, что в описанных условиях опыта дальнейший распад АМФ осуществляется преимущественно путем его дезаминирования. Таким образом, обнаруженное в настоящем эксперименте увеличение активности АМФД свидетельствует об увеличении катаболизма адениловых нуклеотидов в мозге крыс, неоднократно перенесших гипогликемию. Последующее окисление гипоксантина и ксантина в ксантиноксидазной реакции сопровождается продукцией супероксиданион-радикала, что может явиться одним из факторов, способствующих инициации процессов ПОЛ в мозге крыс, перенесших серию гипогликемических ком. Кроме того, увеличение скорости катаболизма адениловых нуклеотидов происходит на фоне уменьшения активности Г-6-ФДГ (см. табл. 1), что может затруднять синтез адениловых нуклеотидов de novo.

Таблица 3

Скорость образования лактата при использовании в качестве субстрата глюкозы и глюкозо-6-фосфат (в нмоль/мин на 1 мг белка) в мозге крыс, перенесших серию гипогликемических ком (X ± <УХ)

НАД-ИЦДГ является одним из потокоформирующих ферментов цикла Кребса [6]. Увеличение ее активности, вероятно, отражает возросшие энергопотребности клеток мозга, обусловленные работой "ионных насосов" при гипогликемии и в восстановительном периоде. Уменьшение активности митохондриальной НАДФ-ИЦДГ (см. табл. 1) также может способствовать перераспределению потока изоцитрата по пути НАД-зависимого окисления. Активность НАД-ИЦДГ и Na+-, К+-АТФа- зы увеличена, а НАДФ-ИЦДГ — снижена также в состоянии гипогликемической комы и в ранние сроки восстановления, однако через 30 мин после введения глюкозы происходит нормализация активности ферментов [9,12]. У животных, перенесших серию ком, подобные изменения активности этих ферментов наблюдаются на 2-е сутки после купирования последней комы. Таким образом, возникающие в ходе глубокой гипогликемии и раннего восстановительного периода изменения сохраняются продолжительное время у крыс, перенесших серию ком, возможно, представляя собой адаптацию обмена мозга к повторяющейся гипогликемии.

В срезах мозга подопытных животных не наблюдали значительных изменений устойчивости мембран клеток в средах с нормальным и пониженным осмотическим давлением. Последнее является косвенным свидетельством относительной сохранности процессов энерго продукции и достаточной работы "ионных насосов" в мозге крыс, перенесших серию гипогликемических ком. Внесение в гипотоническую среду инкубации срезов Fe2+ и аскорбата приводило к существенному увеличению интенсивности цитолиза и сопровождалось нарастанием уровня МДА. Выявленные изменения свидетельствуют о том, что существенным повреждающим фактором в патогенезе постгипогликемической энцефалопатии является снижение способности клеток бороться с активными формами кислорода, О снижении уровня системы антиоксидантной защиты в мозге крыс, подвергнутых гиперинсулинизации, свидетельствуют также уменьшение активности СОД, НАДФ-зависимых Г-б-ФДГ, НАДФ-МДГ, НАДФ-ИЦДГ и ГР (см. табл. 1). С одной стороны, эти ферменты обеспечивают работу системы антиоксидантной защиты, с другой — уменьшение их активности считают результатом развития окислительного стресса [15].

НАДН-ДГ -комплекс также чувствителен к окислительному повреждению [18]. Наблюдали уменьшение активности НАДН-ДГ в состоянии гипогликемической комы: активность фермента нормализуется через 30 мин после купирования однократной гипогликемии глюкозой [9] и оказывается сниженной на 2-е сутки после купирования последней из серии гипогликемических ком (см. табл. 1). Уменьшение НАДН-ДГ-активности, обнаруженное в настоящем эксперименте, может быть связано с окислением FeS-центров комплекса с активными формами кислорода и азота [18], образующимися в нервной ткани при гипогликемии.

Необходимо отметить, что наиболее выраженные изменения активности ферментов сосредоточены в стволе мозга. При этом нарушения гликогенолиза и обмена медиаторных аминокислот при гиперинсулинизации также наблюдаются в стволе мозга [10, 11]. Нарушения обмена, возникающие при неоднократном воздействии гипогликемии на мозг, а именно снижение уровня ГАМК, интенсивности гликогенолиза и активности НАДН-ДГ, являются общими для ряда патологических состояний, в частности, их рассматривают как характерные для болезни Паркинсона [15, 18]. Подобное сходство патохимических проявлений свидетельствует об общем механизме, их индуцирующем. Таким механизмом могут быть эксайтотоксичность глутамата и аспартата и связанная с ней активация процессов перекисного окисления [14, 18].

Комплекс патохимических изменений, возникающих при однократной гипогликемии, сравнительно быстро разрешается после купирования комы глюкозой [9, 12—14], но оказывается более выраженным и наблюдается более продолжительное время у крыс, перенесших серию тяжелых гипогликемических состояний. Существенным элементом патогенеза постгипогликемической энцефалопатии, таким образом, может быть фактор неоднократности воздействия гипогликемии на мозг, приводящий к нарушениям энергетического обмена и стимуляции процессов ПОЛ в нервной ткани.

Выводы