Рассматриваются проблемы биохимической диагностики врожденной дисфункции коры надпочечников, обусловленной прежде всего дефицитом 21-гидроксилазы надпочечников. Приводятся данные о синтезе кортикостероидов в коре надпочечников и обсуждается возможность применения различных биохимических маркеров в неонатальном скрининге и более поздней диагностике врожденной дисфункции коры надпочечников, в том числе 21-дезоксикортизола в крови и прегнантриола и прегнантриалона в моче.
The paper deals with the problems In the biochemical diagnosis of congenital adrenal hyperplasia caused mainly by adrenal 21-hydroxylase deficiency. It presents data on the adrenal cortical synthesis of corticosteroids and discusses whether different biochemical markers, including the levels of blood deoxycortisol and those of urinary pregnantriol and pregnantriolone, may be used in neonatal screening and later diagnosis of congenital adrenal hyperplasia.
Врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН) — группа наследственных аутосомно-рецессивных заболеваний, при которых из-за мутаций в генах, кодирующих ферменты стероидогенеза в коре надпочечников, наблюдается сдвиг в продукции основных стероидных гормонов от кортикостероидов к андрогенам. Результатом этих дефектов является отсутствие или снижение в разной степени синтеза кортизола из его предшественника — холестерина (рис. 1). Из-за недостатка циркулирующего кортизола передняя доля гипофиза (по принципу обратной связи) секретирует повышенные количества АКТГ, под влиянием которого развивается гиперплазия коры надпочечников [2, 15, 19].
Как видно на рис. 1, 7 ферментов обеспечивают синтез глюкокортикоидов, минералокортикоидов и андрогенов в коре надпочечников. Гены для всех этих ферментов были клонированы и охарактеризованы. Ферменты CYP11A1, CYP17, CYP21B, CYP11B1, CYP11B2 связаны с цитохромом Р-450. CYP17 (17-гидроксилаза) присутствует и в коре надпочечников, и в гонадах, тогда как CYP21B (21- гидроксилаза), CYP11B1 (lip-гидроксилаза) и CYP11B2 (18-гидроксилаза) присутствуют только в коре надпочечников, причем CYP17 (17-гидроксилаза) отсутствует в клубочковой зоне, где осуществляется синтез минералокортикоидов, CYP21B (21-гидроксилаза) экспрессируется в пучковой и сетчатой зонах, где происходит синтез глюкокортикоидов и андрогенов, CYP11В1 (11р-гидроксила- за) присутствует в клубочковой и пучковой зонах, а CYP11B2 (18-гидроксилаза) локализована только в клубочковой зоне, где осуществляется синтез минералокортикоидов. Зр-ол-стероиддегидрогеназа участвует в синтезе всех классов кортикостероидов и экспрессируется, кроме коры надпочечников, в гонадах, плаценте и периферических тканях (кожа, жировая ткань).
Более чем в 90% случаев генетические нарушения затрагивают ген, кодирующий 21-гидроксилазу [1, 8]. Эта ферментная система необходима для синтеза как кортизола, так и альдостерона. Зачастую термин ВДКН употребляется как синоним дефекта именно этого фермента. Прямым следствием такого дефекта является усиление синтеза стероидов, которые непосредственно предшествуют ферментативному блоку (17-гидроксилированных производных прогестерона и прегненолона), и андрогенов, путь биосинтеза которых не заблокирован.
Данный синдром имеет достаточно широкий диапазон клинических проявлений и подразделяется на 3 основные формы: наиболее тяжелая соль- теряющая (дефицит кортизола и альдостерона), простая вирильная (классическая, дефицит кортизола) и неклассическая (поздно проявляющаяся).
Тяжесть заболевания зависит от места повреждения гена, которое определяет степень потери активности 21- гидроксилазы. Недостаточность фермента приводит к дефициту двух основных конечных продуктов стероидогенеза (кортизола и альдостерона) и избытку предшественников, накапливающихся перед дефектной ферментной реакцией, т. е. на стадии превращения 17-гидроксипрогестерона в 11-дезокси- кортизол и прогестерона в 11-дезоксикортикостерон. 17-Гидроксипрогестерон может превращаться в тестостерон и другие кортикостероиды через альтернативные пути биосинтеза в коре надпочечников и в других тканях. Именно поэтому у таких больных может наблюдаться неполное отсутствие в крови тех или иных стероидов. Например, у больных с глубоким дефицитом 21-гидроксилазы был обнаружен близкий к нормальному уровень 21- гидроксилированных стероидов, что являлось результатом 21-гидроксилирования предшественников вне надпочечника [
Ген, кодирующий 21-гидроксилазу (CYP21), локализован на коротком плече хромосомы 6 и дублируется его псевдогеном (CYP21P), нефункциональным. Эти гены частично перекрываются, образуя так называемую полигенную область [
В настоящее время не вызывает сомнения существование множества генетических нарушений, приводящих к развитию ВДКН. Как и
В качестве гормонального маркера ВДКН может быть использован и 17-гидроксипрегненолон. Данный маркер используется нами при диагностике ВДКН в течение почти 3 лет с удовлетворительным результатом. Концентрация 17-гидроксипрегненолона у больных с ВДКН превышает норму в 2—3 раза (табл. 1). При определении обычными методами у больных неклассической формой ВДКН может не наблюдаться дефицита кортизола [
У больных с дефицитом 21-гидроксилазы наблюдается более низкий уровень свободного кортизола в моче — 72,6 ± 9,4 нмоль/л, чем у здоровых лиц — 117 ± 17,6 нмоль/л [5, 6].
Из-за дефицита 21-гидроксилазы у больных с ВДКН синтезируются значительные количества 21-дезоксикортизола (рис. 2) — стероида, концентрация которого у здоровых людей чрезвычайно мала (у мужчин — 0,33—0,87 нмоль/л, у женщин — 0,15—1,05 нмоль/л [9, 18]. Совместное использование жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии [11, 20] позволило обнаружить не только высокую концентрацию 17-ок- сипрогестерона (79,9—997 нмоль/л) и низкую концентрацию кортизола (2,5 нмоль/л), но и присутствие значительных количеств 21 -дезоксикортизола (83,7—324,0 нмоль/л).
В настоящее время в связи с внедрением в лабораторную практику автоматизированных систем с прямым безэкстракционным определением кортизола в сыворотке регистрируются завышенные показатели кортизола у больных с ВДКН. Следует вспомнить работу J. Brotherton и В. Rothbart [
при других рецессивных аутосомных патологиях, степень тяжести заболевания и клинические симптомы определяются двумя функционирующими аллелями гена, полученными от отца и матери. Большинство больных с ВДКН гетерозиготны и имеют разные нарушения в каждом аллеле [1, 2].
Наиболее распространенный гормональный маркер дефицита 21-гид- ркосилазы — повышенный уровень 17- гидроксипрогестерона в сыворотке или амниотической жидкости (при пренатальной диагностике) [
Для проверки этого положения нами были проведены следующие исследования: 1) РИА-методом в произвольно выбранных 10 пробах сыворотки от больных с ВДКН определяли содержание кортизола;
Результаты исследования приведены в табл. 2.
Видно, что концентрации кортизола в сыворотке больных с ВДКН значительно превышают соответствующие показатели, полученные для фракции кортизола после хроматографии. Уровень собственно кортизола составляет 4,9 ± 1,0% от общей концентрации стероида. Процент открытия добавленного стандарта 21-дезоксикортизола составлял 114,4 ±10,6. Следовательно 21-дезоксикортизол действительно обладает высоким иммунологическим сродством к антителам к кортизолу и поэтому определяется в иммунной реакции. У больных с ВДКН уровень 21-дезоксикортизола в сыворотке может значительно превышать содержание кортизола, что определяется степенью блока 21-гидроксилазы.
Таблица 2
Результаты определения кортизола в сыворотке крови больных с ВДКН
Больные | I | II | III | IV |
1 | 147,6 | 3,8 | 285,8 | 297,6 |
2 | 192,0 | 16,6 | 440,0 | 342,0 |
3 | 126,9 | 28,2 | 261,8 | 276,9 |
4 | 106,2 | 9,8 | 298,9 | 256,2 |
5 | 283,6 | 7,6 | 512,3 | 433,6 |
6 | 209,1 | 19,4 | 417,5 | 359,1 |
7 | 242,9 | 24,0 | 445,1 | 392,9 |
8 | 234,9 | 40,3 | 372,4 | 384,9 |
9 | 314,2 | 40,1 | 439,3 | 464,2 |
10 | 173,8 | 32,6 | 435,3 | 323,8 |
М | 173,5 | 22,2 | 390,8 | 314,6 |
Медиана | 200,6 | 21,7 | 426,4 | 350,55 |
S | ± 67,3 | ± 13,08 | ± 87,75 | ± 67,25 |
Примечание. I — определение кортизола прямым методом, II — после разделения на колонке "Serhadex LH-20", III — после добавления 21-дезоксикортизола, IV — ожидаемая концентрация кортизола.
Из сказанного выше следует, что определение содержания кортизола обычными прямыми методами иммуноанализа (включая автоматизированные системы) у больных с ВДКН не имеет практической диагностической ценности и его не следует включать в диагностический алгоритм ВДКН.
Уровень кортизола (как химической молекулы) у больных с ВДКН можно определить, только выделив его хроматографически перед количественным определением методами иммуноанализа. Оптимальный вариант — использование метода газовой хроматографии и масс-спектрографии; сочетание этих методов позволяет количественно и качественно оценить весь спектр стероидов, включая и маркеры ВДКН. Высокая стоимость этой технологии и сложность эксплуатации ограничивают ее использование в рутинной лабораторной практике. Она должна быть использована в специализированных референсных лабораториях, организация которых необходима при проведении неонатального скрининга.
Генетические методы выявления ферментативных дефектов при ВДКН внесли важный вклад в решение задачи раннего выявления заболевания. Однако эти методы выполнимы только в специализированных лабораториях при наличии высококвалифицированных специалистов и специального оборудования. Поэтому продолжается поиск дополнительных биохимических маркеров ВДКН. Одни из них предложены японскими авторами [
В рутинной диагностике дефицита 21-гидроксилазы необходимо использовать определение 17-гидроксипрогестерона проверенными иммунологическими методами, а также (желательно)
21-дезоксикортизола и его метаболита методом газовой хроматографии/масс-спектрометрии. Определение кортизола прямыми методами иммуноанализа без использования хроматографии лишено смысла, так как в этом случае вместе с кортизолом определяется близкий ему по структуре 21-дезоксикортизол.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.