Врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН) — группа наследственных аутосомно-рецессивных заболеваний, при которых из-за мутаций в генах, кодирующих ферменты стероидогенеза в коре надпочечников, наблюдается сдвиг в продукции основных стероидных гормонов от кортикостероидов к андрогенам. Результатом этих дефектов является отсутствие или снижение в разной степени синтеза кортизола из его предшественника — холестерина (рис. 1). Из-за недостатка циркулирующего кортизола передняя доля гипофиза (по принципу обратной связи) секретирует повышенные количества АКТГ, под влиянием которого развивается гиперплазия коры надпочечников [2, 15, 19].

Как видно на рис. 1, 7 ферментов обеспечивают синтез глюкокортикоидов, минералокортикоидов и андрогенов в коре надпочечников. Гены для всех этих ферментов были клонированы и охарактеризованы. Ферменты CYP11A1, CYP17, CYP21B, CYP11B1, CYP11B2 связаны с цитохромом Р-450. CYP17 (17-гидроксилаза) присутствует и в коре надпочечников, и в гонадах, тогда как CYP21B (21- гидроксилаза), CYP11B1 (lip-гидроксилаза) и CYP11B2 (18-гидроксилаза) присутствуют только в коре надпочечников, причем CYP17 (17-гидроксилаза) отсутствует в клубочковой зоне, где осуществляется синтез минералокортикоидов, CYP21B (21-гидроксилаза) экспрессируется в пучковой и сетчатой зонах, где происходит синтез глюкокортикоидов и андрогенов, CYP11В1 (11р-гидроксила- за) присутствует в клубочковой и пучковой зонах, а CYP11B2 (18-гидроксилаза) локализована только в клубочковой зоне, где осуществляется синтез минералокортикоидов. Зр-ол-стероиддегидрогеназа участвует в синтезе всех классов кортикостероидов и экспрессируется, кроме коры надпочечников, в гонадах, плаценте и периферических тканях (кожа, жировая ткань).

Более чем в 90% случаев генетические нарушения затрагивают ген, кодирующий 21-гидроксилазу [1, 8]. Эта ферментная система необходима для синтеза как кортизола, так и альдостерона. Зачастую термин ВДКН употребляется как синоним дефекта именно этого фермента. Прямым следствием такого дефекта является усиление синтеза стероидов, которые непосредственно предшествуют ферментативному блоку (17-гидроксилированных производных прогестерона и прегненолона), и андрогенов, путь биосинтеза которых не заблокирован.

Данный синдром имеет достаточно широкий диапазон клинических проявлений и подразделяется на 3 основные формы: наиболее тяжелая соль- теряющая (дефицит кортизола и альдостерона), простая вирильная (классическая, дефицит кортизола) и неклассическая (поздно проявляющаяся).

Тяжесть заболевания зависит от места повреждения гена, которое определяет степень потери активности 21- гидроксилазы. Недостаточность фермента приводит к дефициту двух основных конечных продуктов стероидогенеза (кортизола и альдостерона) и избытку предшественников, накапливающихся перед дефектной ферментной реакцией, т. е. на стадии превращения 17-гидроксипрогестерона в 11-дезокси- кортизол и прогестерона в 11-дезоксикортикостерон. 17-Гидроксипрогестерон может превращаться в тестостерон и другие кортикостероиды через альтернативные пути биосинтеза в коре надпочечников и в других тканях. Именно поэтому у таких больных может наблюдаться неполное отсутствие в крови тех или иных стероидов. Например, у больных с глубоким дефицитом 21-гидроксилазы был обнаружен близкий к нормальному уровень 21- гидроксилированных стероидов, что являлось результатом 21-гидроксилирования предшественников вне надпочечника [14].

Ген, кодирующий 21-гидроксилазу (CYP21), локализован на коротком плече хромосомы 6 и дублируется его псевдогеном (CYP21P), нефункциональным. Эти гены частично перекрываются, образуя так называемую полигенную область [12]. Псевдоген Р450с21А отличается от функционального гена тремя точечными мутациями, каждая из которых препятствует образованию мРНК активной 21-гидроксилазы [21]. Синтезированная при транскрипции псевдогена мРНК принимает участие в регуляции экспрессии функционального Р450с21В-гена [3]. Генетические повреждения, вызывающие дефицит 21- гидроксилазы, включают крупные делеции, крупные или небольшие конверсии и (наиболее часто) точечные мутации [17].

В настоящее время не вызывает сомнения существование множества генетических нарушений, приводящих к развитию ВДКН. Как и

В качестве гормонального маркера ВДКН может быть использован и 17-гидроксипрегненолон. Данный маркер используется нами при диагностике ВДКН в течение почти 3 лет с удовлетворительным результатом. Концентрация 17-гидроксипрегненолона у больных с ВДКН превышает норму в 2—3 раза (табл. 1). При определении обычными методами у больных неклассической формой ВДКН может не наблюдаться дефицита кортизола [15], однако базальные и стимулированные АКТГ уровни 17-оксипрегненолона и 17-оксипрогестерона всегда выше, чем в контроле.

У больных с дефицитом 21-гидроксилазы наблюдается более низкий уровень свободного кортизола в моче — 72,6 ± 9,4 нмоль/л, чем у здоровых лиц — 117 ± 17,6 нмоль/л [5, 6].

Из-за дефицита 21-гидроксилазы у больных с ВДКН синтезируются значительные количества 21-дезоксикортизола (рис. 2) — стероида, концентрация которого у здоровых людей чрезвычайно мала (у мужчин — 0,33—0,87 нмоль/л, у женщин — 0,15—1,05 нмоль/л [9, 18]. Совместное использование жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии [11, 20] позволило обнаружить не только высокую концентрацию 17-ок- сипрогестерона (79,9—997 нмоль/л) и низкую концентрацию кортизола (2,5 нмоль/л), но и присутствие значительных количеств 21 -дезоксикортизола (83,7—324,0 нмоль/л).

В настоящее время в связи с внедрением в лабораторную практику автоматизированных систем с прямым безэкстракционным определением кортизола в сыворотке регистрируются завышенные показатели кортизола у больных с ВДКН. Следует вспомнить работу J. Brotherton и В. Rothbart [4], определявших кортизол у женщин с гирсутизмом и ВДКН пятью различными методами: РИА-3Н после экстракции этанолом, прямой РИА-1251, Дель- фия, Амерляйт, "Synelisa". Многие пациенты с ВДКН имели повышенный уровень кортизола (690 нмоль/л), хотя логически уровень кортизола должен быть низким. Нереально высокие показатели концентрации кортизола обусловлены высокой перекрестной реакцией антисыворотки к нему, прежде всего с 21-дезоксикортизолом. Действительно, в молекулах кортизола и 21-дезоксикортизола имеются идентичные иммуноактивные функциональные группы: 11₽- и 21-гидроксилы. Завышение уровней кортизола при этом оказывается прямо пропорциональным содержанию 21-дезоксикортизола в пробе и обратно пропорциональным степени дефицита 21-гидроксилазы [7].

при других рецессивных аутосомных патологиях, степень тяжести заболевания и клинические симптомы определяются двумя функционирующими аллелями гена, полученными от отца и матери. Большинство больных с ВДКН гетерозиготны и имеют разные нарушения в каждом аллеле [1, 2].

Наиболее распространенный гормональный маркер дефицита 21-гид- ркосилазы — повышенный уровень 17- гидроксипрогестерона в сыворотке или амниотической жидкости (при пренатальной диагностике) [16]. Степень повышения этого стероида определяется формой ВДКН: при классической форме его уровень возрастает в десятки раз, при неклассической — может быть в пределах физиологических колебаний, и только проба с АКТГ сопровождается значительно повышенным выбросом этого соединения.

Для проверки этого положения нами были проведены следующие исследования: 1) РИА-методом в произвольно выбранных 10 пробах сыворотки от больных с ВДКН определяли содержание кортизола;

Результаты исследования приведены в табл. 2.

Видно, что концентрации кортизола в сыворотке больных с ВДКН значительно превышают соответствующие показатели, полученные для фракции кортизола после хроматографии. Уровень собственно кортизола составляет 4,9 ± 1,0% от общей концентрации стероида. Процент открытия добавленного стандарта 21-дезоксикортизола составлял 114,4 ±10,6. Следовательно 21-дезоксикортизол действительно обладает высоким иммунологическим сродством к антителам к кортизолу и поэтому определяется в иммунной реакции. У больных с ВДКН уровень 21-дезоксикортизола в сыворотке может значительно превышать содержание кортизола, что определяется степенью блока 21-гидроксилазы.

Таблица 2

Результаты определения кортизола в сыворотке крови больных с ВДКН

Примечание. I — определение кортизола прямым методом, II — после разделения на колонке "Serhadex LH-20", III — после добавления 21-дезоксикортизола, IV — ожидаемая концентрация кортизола.

Из сказанного выше следует, что определение содержания кортизола обычными прямыми методами иммуноанализа (включая автоматизированные системы) у больных с ВДКН не имеет практической диагностической ценности и его не следует включать в диагностический алгоритм ВДКН.

Уровень кортизола (как химической молекулы) у больных с ВДКН можно определить, только выделив его хроматографически перед количественным определением методами иммуноанализа. Оптимальный вариант — использование метода газовой хроматографии и масс-спектрографии; сочетание этих методов позволяет количественно и качественно оценить весь спектр стероидов, включая и маркеры ВДКН. Высокая стоимость этой технологии и сложность эксплуатации ограничивают ее использование в рутинной лабораторной практике. Она должна быть использована в специализированных референсных лабораториях, организация которых необходима при проведении неонатального скрининга.

Генетические методы выявления ферментативных дефектов при ВДКН внесли важный вклад в решение задачи раннего выявления заболевания. Однако эти методы выполнимы только в специализированных лабораториях при наличии высококвалифицированных специалистов и специального оборудования. Поэтому продолжается поиск дополнительных биохимических маркеров ВДКН. Одни из них предложены японскими авторами [10]: метаболиты 17-гидроксипрогестерона и 21-де- зоксикортизона в моче (см. рис. 2) — прегнантриол и прегнантрионолон. Методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией были убедительно показаны преимущества неинвазивного метода определения прегнантрионолона в моче новорожденных по сравнению с существующим методом неонатального скрининга (определение 17-гидроксипрогестерона в капиллярной крови) как по чувствительности, так и по специфичности. В работе также приводятся результаты сравнительного определения 17-гидроксипрогестерона различными методами иммуноанализа. Все они по чувствительности и специфичности уступают методу определения прегнантрионолона в моче. Следует отметить, что использование приведенной технологии как референсной необходимо предусмотреть при организации специализированных лабораторий по Национальной программе скрининга новорожденных на ВДКН.