Цель настоящего исследования - доказать, что концентрация свободного тестостерона (сТ) в слюне хорошо коррелирует с концентрацией несвязанного тестостерона в сыворотке мужчин. Опубликованные к настоящему времени статьи демонстрируют, что результаты измерения, особенно автоматическими системами, не корректны. Новый люминесцентный иммуноанализ (ЛИА) введен в настоящее время в практику. Высокая аналитическая (6,2 пмоль/л) и функциональная (17,3 пмоль/л) чувствительность позволяет количественно определить очень низкие концентрации в слюне. Концентрация сТ в слюне у здоровых мужчин утром была 369 пмоль/л (медиана) с разбросом 263-544 пмоль/л, что статистически значительно выше, чем у мужчин с андрогенным дефицитом - 215 пмоль/л (медиана) с разбросом 51-249 пмоль/л. Повторное определение сТ слюне (1 раз в 1 нед в течение 5 нед) показало высокую стабильность результатов во времени с коэффициентом вариации 9% (разброс 5-23%). В этом исследовании мы показали, что сТ в утренней порции слюны хорошо коррелирует с вычисленным сТ в крови и у здоровых мужчин (R = О,754, р = 0,001), и у пациентов с андрогенным дефицитом (R = 0,889, р = 0,0001).
The study was undertaken to provide evidence that the salivary concentration of free testosterone (FT) well correlates with the serum level of unbound testosterone in men. Recent articles demonstrate that the results obtained by the use of especially automatic systems are incorrect. Anew luminescence enzyme immunoassay has been now put into practice. Its high analytical (6.2 pmol/l) and functional (17.3 pmol/l) sensitivities allow the quantification of minor salivary concentrations. In healthy males, the morning salivary concentration was 369 pl/lmo (median) with a range of 263-544 pmol/l, which is statistically higher than that in males with androgen deficiency (215 pl/lmol/I (median) with a range of 51-249 pmol/l. Once-weekly remeasurement of salivary FT during 5 weeks showed the high stability of results over time with a variation coefficient of 9% (range 5-23%). The study indicated that FT in the morning salivary sample well correlates with the calculated FR in the blood of both healthy males (R = 0.754; p = 0.001) and patients with androgen deficiency (R = 0.889; p = 0.0001).
Проблема андрогенного дефицита, включая возрастной гипогонадизм, широко распространенный у мужчин старше 50 лет, привлекает в последнее время большое внимание исследователей. Андрогенный дефицит не имеет строго специфичных симптомов, поэтому объективным критерием данного синдрома являются сниженный уровень циркулирующего общего тестостерона (оТ) — менее 11 — 12 нмоль/л — и понижение продукции сперматозоидов. Снижение уровня оТ регистрируется у 7% мужчин в возрасте 40—60 лет и у 21% мужчин 60—80 лет. Возрастной дефицит тестостерона может быть обусловлен нарушением как гипоталамо- гипофизарного звена, так и непосредственно секреторной функции клеток Лейдига [
Тестостерон циркулирует в крови в комплексе со специфическим транспортным глобулином (СССГ) — 44—65% и неспецифическим белком альбумином — 35—50%, который имеет низкую аффинность, но большую емкость за счет высокой концентрации в крови. И только 1—2% тестостерона циркулирует в крови в свободном виде. Константа ассоциации тестостерона, связанная с СССГ, высокая (109 л/моль), тогда как с альбумином она намного ниже (3,6 • 104 л/моль). Приведенные параметры детерминируют и скорость диссоциации тестостерона с СССГ — около 20 с, а с альбумином — около 1 с, что определяет его биодоступность к тканям-мишеням при прохождении через стенку капилляра. Свободный тестостерон (сТ) и связанный с альбумином тестостерон обозначают как биологически активную форму гормона.
Вопрос о биологической роли комплекса тестостерона с СССГ остается открытым, большинство исследователей рассматривают его как буферную систему, препятствующую быстрой деградации тестостерона в печени, а некоторые авторы допускают его биологическое негеномное действие через мембранные рецепторы клетки [
Начиная с конца 60-х годов прошлого века основным методом определения оТ в сыворотке стал радиоиммунологический анализ (РИА) с предварительной экстракцией его этиловым эфиром. Он принципиально изменил возможности диагностики различных форм андрогенного дефицита. Однако использование радиоактивной метки в методах РИА создавало целый ряд проблем для гормональных лабораторий.
Наиболее популярной альтернативой РИА стало развитие иммуноферментного анализа (ИФА), где в качестве меченого компонента используется пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и др., флюоресцентных методов (меченый компонент европий), метода усиленной люминесценции (меченый компонент люминол или акридин).
Проведенные в последнее время сравнения способов определения тестостерона в сыворотке крови: с помощью автоматизированных систем и референсного метода, каким является масс-спектро- метрик, показали наличие систематической ошибки как в сторону завышения (в большинстве случаев), так и в сторону занижения содержания определяемого тестостерона [10, 14]. Аналогичные результаты были получены при сравнении четырех автоматизированных систем со стандартизированным РИА [
зо
Как подчеркивалось выше, наиболее оптимальным маркером андрогенного статуса является свободная биологически активная форма тестостерона. Однако прямое определение сТ в крови сопряжено с определенными технологическими трудностями. Поэтому мы обратились к альтернативной биологической жидкости — слюне, куда поступает только сТ.
Слюна как биологическая жидкость привлекла внимание исследователей почти 50 лет назад, так как в слюнной проток проникают соединения только с низким молекулярной массой, к которым относится и тестостерон, не связанный с альбумином и специфическим глобулином. Концентрация жирорастворимых свободных стероидов, таких как тестостерон, не зависит от скорости выделения слюны и практически равна уровню несвязанной формы стероида в сыворотке крови [
Однако РИА-методы в то время были недостаточно чувствительны и не могли определить низкие концентрации свободных стероидов в слюне. Для анализа требовались большие объемы слюны (до 3 мл), после сбора слюны следовала неприятная процедура экстракции диэтиловым эфиром, который является огне- и взрывоопасным растворителем. В результате такую технологию было сложно адаптировать для клинической диагностики в биохимических лабораториях.
Диагностические наборы для прямого измерения свободных стероидов, в особенности для тестостерона в крови, пока не пригодны для диагностического исследования и могут использоваться лишь в научных целях [8,13]. Как известно, группой A. Vermeulen [
Лишь появление новой современной технологии иммуноанализа, основанной на усиленной хемилюминесценции [
Цель настоящего исследования — доказать, что концентрация сТ в слюне хорошо коррелирует и отражает концентрацию несвязанного тестостерона в крови, а кроме того, является дополнительным существенным диагностическим критерием для определения андрогенного статуса мужчин.
Пациенты. Были обследованы следующие группы мужчин:
Процедура сбора слюны. Чтобы исследовать колебания концентрации тестостерона, 3 порции слюны собирали в течение 1 ч трижды в день по следующей схеме:
образец 1 — в 8.30 ч, образец 2 — в 9.00 ч, образец 3 — в 9.30 ч, образец 4 — в 15.30 ч, образец 5
Наш опыт показал, что правильный сбор слюны
ключевой момент в достижении точных и воспроизводимых результатов измерения сТ, поэтому мы разработали детальную процедуру сбора слюны. Образцы слюны собирали в специальные контейнеры (SaliCaps®, IBL) со специальной трубочкой, изготовленной из материала, который не сорбирует стероиды. Сбор осуществляли не менее чем через 30 мин после еды, питья, чистки зубов или жевания жвачки. Требовалось примерно 2 мин, чтобы собрать необходимое количество слюны (0,6— 0,8 мл). Образцы с небольшим окрашиванием из- за контаминации кровью были отбракованы. Все образцы помечали специальным маркером (имя пациента, дата, время). Собранная слюна могла храниться до 5 дней при 20°С, 10 дней при 2—8°С и 6 мес и более при -20’С. сТ измеряли в 50 мкл слюны в дубликатах.
| Таблица 1. Гормональная характеристика исследуемых групп (медиана и 10/90 перцентили) | |||||
| Группа | п | Средний возраст, годы | оТ, нмоль/л | СССГ, нмоль/л | всТ, пмоль/л |
| Здоровые мужчины | 31 | 38 (от 25 до 52) | 18,8 (12,4-26,1) | 36,1 (21-54) | 374 (225-544) |
| Мужчины с андрогенным дефицитом | 14 | 35 (от 21 до 54) | 6,7 (1,2-10,8) | 33,0 (14,7-104,1) | 135 (9,3-215) |
| Р | 0,2242 | 0,0000 | 0,3958 | 0,0000 |
Приводили некоторые приемы для быстрого и простого сбора слюны:
Процедура сбора крови. Образцы крови собирали между 8.00 и 10.00 ч утра в день сбора слюны. Образцы сыворотки хранили при —20°С в двух аликвотах до измерения в них содержания оТ и СССГ.
Уровень сТ определяли методом люминесцентного иммуноанализа (ЛИА) (фирма IBL-Гамбург, Германия), основанным на принципе конкурентного связывания. Регистрацию люминесцентного сигнала проводили на мультианализаторе "Victor" (фирма "Wallac", Финляндия).
Уровень оТ в образцах крови определяли методом усиленной хемилюминесценции с помощью автоматического анализатора Vitros ECi ("Ortho- Clinical Diagnostics, J&J", Великобритания).
Содержание СССГ определяли методом отсроченной по времени флюоресценции с помощью автоматизированной системы Autodelfia (фирма "Wallac", Финляндия).
Концентрацию сТ в крови вычисляли с помощью математической формулы, использующей показатели в крови оТ и СССГ и описанной в работе A. Vermeulen и соавт. [
Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы Statictica, StatSoft, Inc. (1999). Результаты представлены в виде медианы и 10/90-перцентилей. Для выявления значимости различий между сравниваемыми параметрами использовали тест Манна—Уитни. Для оценки связи между различными показателями применяли ранговый тест Спирмена и линейный регрессионный анализ. Различия р < 0,05 считали статистически значимыми.
Концентрация оТ, уровень СССГ, вычисленный сТ (всТ) в крови и средний возраст здоровых мужчин представлены в табл. 1. Обнаружено, что сопоставимые по возрасту здоровые мужчины и мужчины с андрогенным дефицитом имели схожий уровень СССГ (медиана была равна соответственно 36,1 и 33 нмоль/л). Однако уровень оТ оказался значительно выше в группе здоровых мужчин (18,8 и 6,7 нмоль/л). Концентрация всТ в крови у здоровых мужчин также была в 3 раза выше, чем у пациентов с андрогенным дефицитом (374 и 135 пмоль/л).
Средние уровни сТ в утренних, дневных и вечерних образцах слюны приведены в табл. 2.
Концентрация тестостерона в слюне у здоровых мужчин (по 3 утренних образца от каждого, всего 36 образцов) была 380 пмоль/л (270—544 пмоль/л). Средняя концентрация днем и вечером — соответственно 80 ± 15 и 71 ±21% от утренней концентрации (рис. 1).
В отличие от здоровых мужчин у больных суточная динамика сТ в слюне менее выражена. Концентрация сТ утром и днем практически не различалась, статистически значимое различие было обнаружено только вечером — 68 ± 29% от утреннего уровня (рис. 2).
Концентрации сТ в слюне и всТ в крови у здоровых мужчин практически не различались: 380 пмоль/л (270—544 пмоль/л) и 374 пмоль/л (225— 544 пмоль/л; р = 0,111) (рис. 3), тогда как у пациентов с андрогенным дефицитом концентрация сТ часто отличалась от всТ в крови. Медиана сТ в 3 утренних образцах слюны была выше (215 пмоль/л, от 55 до 249 пмоль/л), чем всТ в крови, — 135 пмоль/л (от 9,3 до 215 пмоль/л) (рис. 4).
У пациентов с андрогенным дефицитом, имеющих очень низкий уровень оТ в крови, выявлены значительные различия между содержанием сТ в слюне и всТ в крови:
Однако, несмотря на вышеперечисленные расхождения между абсолютными концентрациями сТ в слюне и крови, между этими двумя показателями обнаружена корреляция (коэффициент регрессии 0,889, р = 0,0000), а диагностическая значимость определения сТ в слюне в группе пациентов с андрогенным дефицитом достигала 100%.
Чтобы изучить воспроизводимость концентрации сТ в слюне во времени, мы собирали слюну в группе здоровых мужчин в течение 5 нед (1 раз в 1 нед утром). В начале исследования (1-я нед) концентрация сТ у обследуемых была в пределах 180— 745 пмоль/л. Последующие определения тестостерона (2—5-я нед) показали высокую воспроизводимость результатов (коэффициент вариации 9% — от 5 до 23%) (рис. 5). На рис. 6 представлены примеры индивидуальной динамики у 4 мужчин данной группы: 2 — с уровнем ниже медианы (медиана 374 пмоль/л) и 2 — выше медианы.
Следующий важный аспект — мониторинг заместительной терапии андрогенами по уровню сТ в слюне. Мы проводили мониторинг сТ в слюне у транссексуала (женщина -> мужчина) после лечения сустаноном. До лечения уровень оТ и всТ в крови был очень низок (соответственно 3,9 нмоль/л и 42,3 пмоль/л). Через 1 нед после инъекции сустанона уровень оТ в крови вырос на 29%, концентрация сТ в крови — на 140%, тогда как содержание сТ в слюне возросло утром на 275% и вечером на 527% (рис. 7).
Таким образом, можно сделать заключение, что мониторинг заместительной терапии андрогенами более адекватен при определении сТ в слюне с помощью ЛИА-технологии. С этим методом достаточно просто изучать фармакокинетику в каждом отдельном случае с тем, чтобы подбирать оптимальную дозу препарата и пути его введения.
В настоящее время для обозначения биологической андрогенной активности часто используется термин "андрогенный статус пациента", основанный на определении оТ. С клинической и научной точки зрения, этот термин неудачен. Измерение оТ в сыворотке прямым безэкстракционным методом показало значительные количественные различия при использовании современных иммунофермент- ных технологий [4, 10, 15]. Все тестируемые методы по сравнению с "золотым стандартом" — газовой хроматографией в сочетании с масс-спектрометрией имеют значительный сдвиг в сторону завышения результатов, особенно при измерении низкого уровня тестостерона, т. е. ниже 12 нмоль/л. Ни один из методов (за исключением РИА с преана- литической экстракцией) не может обеспечить точное количественное определение уровня тестостерона в диапазоне низких концентраций как у здоровых мужчин, так и у пациентов с андрогенным дефицитом.
Уровень тестостерона в слюне хорошо коррелирует с несвязанным тестостероном в крови. Поскольку именно свободная фракция тестостерона обладает биологической активностью, тестостерон в слюне является более адекватным индикатором биологической активности стероида, чем оТ в сыворотке, особенно в условиях изменения связывающей способности СССГ. Техника сбора проста, неинвазивна и не травмирует пациента, поэтому возможны частый сбор слюны и пересылка ее почтой [
Разброс нормальных значений сТ у здоровых мужчин в утренних образцах, полученный в данной работе, согласуется с таковым, описанным ранее [
Другая группа [
В нашем исследовании мы также определили концентрацию слюнного тестостерона у здоровых мужчин в течение 5 нед. Было показано, что изменения концентрации сТ в слюне незначительны (коэффициент вариации 9%, разброс 5—23%), но имеют индивидуальные количественные различия.
Таким образом, с введением в практику очень чувствительной и специфичной ЛИА-технологии концентрация тестостерона в слюне может широко использоваться как объективный и адекватный гормональный критерий в диагностике различных форм гипогонадизма у мужчин, а его определение Л ИА-методом может служить методом выбора для целого ряда научных исследований, мониторинга и лечения гонадальных дисфункций, включая изучение фармакокинетики производных тестостерона при заместительной терапии.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.