Врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН, врожденная гиперплазия надпочечников, адреногенитальный синдром) — группа заболеваний с аутосомно-рецессивным характером наследования, в основе которых лежит нарушение одного из этапов биосинтеза кортизола в коре надпочечников. Хронический дефицит кортизола по принципу отрицательной обратной связи стимулирует секрецию АКТГ, что и служит причиной гиперплазии коры надпочечников. Недостаточность стероидогенных ферментов приводит к накоплению промежуточных продуктов стероидогенеза, а также к активации альтернативных путей синтеза стероидов. В настоящее время различают 6 клинических форм, обусловленных дефектами 7 генов: 1) липоидная гиперплазия надпочечников (гены STAR или CYP11A1); 2) дефицит 30-ГСД (ген HSD3B2); 3) дефицит Р450с17 (ген CYP17A1); 4) дефицит Р450с21 (ген CYP21A2); 5) дефицит Р450с11 (ген CYP11B1); 6) дефицит Р450 оксидоредуктазы (ген POR).

Наиболее распространенными являются формы, обусловленные дефектами генов CYP21A2 (более 90% случаев) и CYP11B1 (около 5% случаев) [2, 20], тогда как мутации генов HSD3B2, CYP17A1,CYP11A1, STAR и POR встречаются значительно реже и влекут за собой нарушение стероидогенеза не только в надпочечниках, но и в гонадах.

Дефицит Зр-гидроксистероиддегидрогеназы (Зр-ГСД) — редкая форма ВДКН, составляющая в структуре ВДКН не более 1% [5] и проявляющаяся выраженной глюко- и минералокортикоидной недостаточностью.

Зр-ГСД — это микросомальный ферментный комплекс, включающий Зр-окси-Д5-стероиддегид- рогеназу и Д5-Д4-изомеразу. Впервые описан в 1951 г. L. Samuels и соавт. [16]. Известно, что он локализуется в эндоплазматическом ретикулуме и на митохондриях и участвует в процессах превращения прегненолона в прогестерон, 17-гидроксипрег- ненолона — в 17-гидроксипрогестерон (17-ОНР) и дегидроэпиандростерона — в андростендион. Помимо этого, Зр-ГСД также катализирует реакции формирования и распада 5-а-андростанов и 5-а- прегнанов, таких как дегидротестостерон и дегидропрогестерон [8, 12, 18]. Таким образом, данный фермент ответствен за основные реакции стероидогенеза в надпочечниках, гонадах, плаценте, а также в различных периферических тканях [9].

Обнаружено 2 разновидности фермента, кодирующиеся двумя различными генами, расположенными на коротком плече 1 хромосомы (1р13.1) Ген HSD3B1 экспрессируется в плаценте и периферических тканях (почках, печени и т. д.), ген HSD3B2 — в гонадах и надпочечниках. Зр-ГСД 1-го типа обладает большей аффинностью в реакциях, что делает их возможными даже на периферии в условиях низких концентраций субстратов стероидогенеза [7].

Классический вариант дефицита Зр-ГСД проявляется выраженной глюко- и минералокортикоидной недостаточностью, манифестирующей в первые дни жизни. Помимо этого, у генетических мальчиков (46, XY) в связи с недостаточной продукцией андрогенов во внутриутробном периоде не происходит маскулинизации наружных гениталий, что приводит к развитию ложного мужского гермафродитизма. У девочек (46, XX) выявляются гипертрофия клитора и умеренная вирилизация наружных гениталий, что связано с избытком продукции дегидроэпиандростерон-сульфата (ДГЭА- С), часть из которого преобразуется в тестостерон под воздействием сохранной вненадпочечниковой Зр-ГСД.

До настоящего времени описания пациентов с недостаточностью Зр-ГСД в отечественной литературе отсутствовали. В данной статье мы впервые представляем результаты обследования и лечения 2 сибсов с данным заболеванием. Диагноз в обоих случаях был верифицирован по результатам молекулярно-генетического обследования — выявления мутации в гене HSD3B2.

Методы исследования

Гормональные исследования. Уровень 17-ОНР, тестостерона, ДГЭА-С, прогестерона, лютеинизирующего гормона (ЛГ), фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), эстрадиола и активности ренина

Рис. 1. Схема гена HSD3B2 с обозначением олигонуклеотидов, использованных при ПЦР и секвенировании. Экзоны пронумерованы римскими цифрами.

в плазме (АРП) определяли с использованием коммерческих наборов.

Молекулярно-генетические исследования. Геномную ДНК выделяли из периферических лейкоцитов с использованием стандартных методов. С помощью ПЦР амплифицировали 2 фрагмента геномной ДНК, охватывающих кодирующую последовательность гена HSD3B2 с примыкающими участками интронов: фрагмент Е2 (342 п.н., экзон 2) и фрагмент ЕЗ—4 (3357 п.н., экзоны 3, 4) (рис. 1). После электрофореза в 1% агарозном геле продукты ПЦР выделяли и очищали с использованием набора MinElute PCR Purification Kit ("Qiagen"), а затем секвенировали на автоматическом секвенаторе ABI PRISM Model 3100 ("Applied Biosystems", США). ДНК секвенировали в Межинститутском центре коллективного пользования "ГЕНОМ" ИМБ РАН (http://www.genome-centre.narod.ru/), организованном при поддержке РФФИ (грант № 00-04-55000).

При проведении ПЦР и последующем секвенировании соответствующих экзонов и примыкающих участков интронов использовали следующие олигонуклеотиды (см. рис. 1):

E2F, 5'-GGGTCACGCTAGAATCAGATCTG-3';

E2R, 5’-GATGTGTGACTGGCTTTCATTTG-3': E3F, 5'-CTTCCCAGCCAGATCCAGAAATC-3'; E4F, 5'-CGGCTGTATCATGACCCAATC-3'; E4R, 5'-CCTGGGCTTGTGCCCCTGTTG-3'.

Клиническое описание случаев

Больная К., 13 лет, от4-й беременности, 1-х срочных родов (1-я беременность — спонтанный выкидыш на 10—11-й неделе, 2-я беременность — внематочная, 3-я — медицинский аборт). Родители здоровы. При рождении масса тела 3100 г, рост 51 см. Зарегистрирована в женском поле. С рождения отмечалась умеренная вирилизация наружных гениталий, гипертрофия клитора. Кариотип 46, XX. Заподозрен адреногенитальный синдром, терапия не назначалась. Выписана из роддома на 4-е сутки. С первых дней жизни плохой аппетит, сосала вяло. В возрасте 3 нед появились срыгивания, рвота. За 1-й месяц потеря массы тела 500 г. В 1,5 мес девочка госпитализирована по месту жительства, где на основании клинической картины выставлен диагноз ВДКН, сольтеряющая форма. Назначена заместительная терапия глюкокортикоидами (преднизолон 2,5 мг/сут) и минералокортикоидами (кортинефф 0,075 мг/сут). В 1 год 4 мес в связи с незначительной гипертрофией клитора и симптомами передозировки глюкокортикоидами диагноз был подвергнут сомнению. Однако при попытке снижения доз глюкокортикоидов у девочки развилась картина надпочечниковой недостаточности. В дальнейшем постоянно получала лечение.

В ЭНЦ РАМН обследована впервые в возрасте 13 лет. На момент поступления клинически девочка компенсирована по основному заболеванию. При обследовании в гормональном профиле 17-ОНР 23,2 нмоль/л (норма 0,45—3,3 нмоль/л), ДГЭА-С 13 600 нмоль/л (норма 2680—9230 нмоль/л), АРП 0,4 нг/мл/ч (норма 0,5—1,9 нг/мл/ч), тестостерон 0,8 нмоль/л (норма 0,7—1,8 нмоль/л), прогестерон 4,9 нмоль/л (норма 0,4— 5,4 нмоль/л) на фоне приема кортефа 20 мг/сут, кортинеффа 0,075 мг/сут). В биохимическом анализе крови электролиты в пределах нормы.

Повторно обследована в ЭНЦ РАМН через 1 год в возрасте 14,5 года. Течение заболевания на фоне терапии глюкокортикоидами (кортеф 17,5 мг/сут) и минералокортикоидами (кортинефф 0,05 мг/сут) стабильное. Однако сохранялись клинические признаки гиперандрогении (acnae vulgaris, гирсутизм), а также жалобы на нарушенный менструальный цикл по типу пройоменореи. Объективно при обследовании: рост 158,5 см (SDS = -0,34) (зоны роста закрыты), масса тела 62,5 кг, ИМТ 24,8 (SDS ИМТ + 1,64). Объективно при осмотре: кожа смуглая, на спине, груди, лице множественные acnae vulgaris, на бедрах и животе отмечаются множественные стрии; выраженный гирсутизм, особенно по внутренней поверхности бедер. Со стороны органов дыхания, сердечно-сосудистой системы, желудочно- кишечного тракта — без патологии. Половой статус — Tanner 4—5. Наружные половые органы сформированы неправильно. Вирилизация Prader 2. В гормональном профиле: 17-ОНР 6,7 нмоль/л (норма 0,45—3,3 нмоль/л), ДГЭА-С 14 180 нмоль/л (норма 2680—9230 нмоль/л), АРП 4,2 нг/мл/ч (норма 0,5— 1,9 нг/мл/ч), тестостерон 0,99 нмоль/л (норма 0,7—1,8 нмоль/л), эстрадиол 96 пмоль/л (норма 50—620 пмоль/л), ФСГ 3,6 Ед/л (норма 2—11,6 Ед/л), ЛГ 9,5 Ед/л (норма 2,6—12,1 Ед/л), секс- стероидсвязывающий глобулин 42,3 нмоль/л (норма 26,1— 110 нмоль/л), прогестерон 8,3 нмоль/л (норма 0,4—5,4 нмоль/л). В биохимическом анализе крови электролиты в пределах нормы. По данным УЗИ органов малого таза: фолликулярная киста правого яичника, эхографические признаки синдрома поликистозных яичников (СПКЯ).

Девочке рекомендован прием преднизолона в комбинации с корте фом.

Больной К., 8 мес, от 8-й беременности, 3-х срочных родов (1-я беременность — спонтанный выкидыш на 10—11-й неделе, 2-я беременность внематочная, 3-я —медицинский аборт, 4-я — девочка 13 лет с сольтеряющей формой ВДКН; 5-я девочка 7 лет, здорова; 6, 7-я — медицинский аборт). Родители здоровы, брак не близкородственный. При рождении масса тела 3700 г, рост 54 см. Отмечалось неправильное строение наружных гениталий: расщепленная мошонка с пальпируемыми в ней тестикулами, микропенис, мошоночная гипоспадия. Кариотип 46, XY. Зарегистрирован в мужском поле. При осмотре в отделении неонаталогии состояние ребенка тяжелое; мальчик вял, адинамичен; отмечена мышечная дистония. На 4-й день жизни у ребенка развился сольтеряющий криз. В анализах крови тестостерон 3,95 нг/мл, ДГЭА-С 2,15 мкг/мл, кортизол 50,4 нг/мл, К+ 5,8 ммоль/л, Na* 119 ммоль/л. Начата заместительная гормональная терапия кортизоном и кортинеффом, на фоне которой отмечалось улучшение состояния. Выписан в возрасте 2 нед в удовлетворительном состоянии. В возрасте 1 мес переведен на терапию преднизолоном в комбинации с кортинеффом. На фоне терапии электролиты крови, кортизол, 17-ОНР, ДГЭА-С в пределах нормы. При попытке отмены приема преднизолона развился криз надпочечниковой недостаточности. В возрасте 7 мес переведен на кортеф 10 мг/сут, кортинефф 0,075 мг/сут-

Впервые госпитализирован в ЭНЦ РАМН в возрасте 8 мес. На момент поступления признаки передозировки глюкокортикоидов. В гормональном статусе: 17-ОНР 2,8 нмоль/л (норма 0,27—9,1 нмоль/л), ДГЭА-С 68 нмоль/л (норма 100—800 нмоль/л), АРП 0,6 нг/мл/ч (норма 0,5—1,9 нг/мл/ч), тестостерон < 0,1 нмоль/л (норма 0,3—0,6 нмоль/л), прогестерон 0,03 нмоль/л — на фоне приема кортефа 10 мг/сут, кортинеффа 0,075 мг/сут. В биохимическом анализе крови электролиты в пределах нормы. Ребенку выполнена стимуляционная проба с ХГЧ. На фоне стимуляции тестостерон 0,3 нмоль/л.

Диагностика дефицита 3/3-ГСД. Наличие у 2 сибсов клиники недостаточности глюко- и минералокортикоидов в сочетании с проявлениями ложного гермафродитизма, как при женском, так и при мужском генетическом поле, а также выявление у одного из пациентов повышенного уровня ДГЭА-С при умеренном повышении уровня 17-ОНР позволило нам заподозрить дефицит Зр-ГСД.

При молекулярно-генетическом исследовании гена HSD3B2 у обоих сибсов была обнаружена го-

Рис. 2. Фрагменты последовательности экзона 4 гена HSD3B2: а — гомозиготная нонсенс-мутация — замена G > А в кодоне триптофана (TGG) в положении 230 с образованием стоп-кодона (W2230X) у пациента К.; б — гетерозиготная мутация в данном положении у отца пациента; в — нормальная последовательность; R—А или G — обозначения нуклеотидов.

мозиготная нонсенс-мутация — замена нуклеотидного основания G на А в кодоне триптофана (TGG) (рис. 2) в положении 230, что приводит к образованию стоп-кодона TGA (W230X). Такая мутация на уровне трансляции будет проявляться синтезом неполноценного белка Зр-ГСД, содержащего лишь 229 из 372 аминокислотных оснований. Мать и отец оказались гетерозиготными носителями данной мутации (см. рис. 2).

Обсуждение

Первые публикации, описывающие случаи недостаточности Зр-ГСД, датированы 1962 г. и принадлежат А. Bongiovanni и соавт. [3, 4]. В настоящее время в литературе имеются многочисленные сообщения о данном заболевании.

Классические формы недостаточности Зр-ГСД являются результатом мутаций в гене HSD3B2, тогда как ген HSD3B1 у больных не поврежден [10, 13, 17]. Дефицит Зр-ГСД принято классифицировать на сольтеряющую и несольтеряющую формы.

Как было сказано выше, клинически данная форма ВДКН проявляется выраженной минерало- и глюкокортикоидной недостаточностью, а также гермафродитным строением наружных гениталий как у мальчиков, так и у девочек. У мальчиков, как правило, отмечаются выраженные нарушения формирования наружных половых органов: промежностная, промежностно-мошоночная гипоспадии, микропенис, крипторхизм, расщепленная мошонка. Часто такие дети регистрируются в женском поле. У девочек же обычно отмечается умеренная вирилизация наружных гениталий, незначительная гипертрофия клитора. Сольтеряющие формы заболевания, как правило, диагностируются на первых месяцах жизни. Диагностика неклассических форм часто бывает поздней в связи с отсутствием выраженной клинической картины (в особенности у девочек) в допубертатном возрасте [15].

Дифференциальная диагностика различных вариантов ВДКН в первую очередь построена на определении кетостероидов крови. При гормональном исследовании выявляется повышение уровня прегненолона, 17-гидроксипрегненолона, ДГЭА, ДГЭА-С; отношение Д5-стероидов к Д4-стероидам увеличено. Наиболее достоверным критерием диагностики недостаточности Зр-ГСД на данный момент принято считать увеличение уровня 17-гидроксипрегненолона на стимуляционной пробе с АКТГ до 100 нмоль/л и более [19]. Выброс тестостерона в ответ на стимуляцию ХГЧ обычно низкий у маленьких детей, но может приближаться к нормальным значениям в пубертате [14]. Данный феномен связан с более высокой активностью Зр- ГСД 1-го типа в этом возрасте. Часто у детей с этой патологией выявляется повышение уровня 17-ОНР в плазме крови, что может быть результатом действия сохранной Зр-ГСД 1-го типа или ошибкой метода, когда 17-гидроксипрегненолон определяется в анализах как 17-ОНР. Данная картина лабораторных показателей часто приводит к ошибочной диагностике 21-гидроксилазной недостаточности, как это было в ситуации с нашей пациенткой. Y. Morel и соавт. было предложено контролировать уровень 17-гидроксипрегненолона у девочек с повышенным уровнем 17-ОНР крови и нормальным строением наружных гениталий, а также у мальчиков с гермафродитным строением наружных половых органов и наличием клинической симптоматики ВДКН [11].

Большое значение в диагностике недостаточности Зр-ГСД имеет семейный анамнез, особенно, когда речь идет о больной девочке [6]. Наличие в роду ранней детской смертности, псевдогермафродитизма у мужчин и/или больных ВДКН должно быть поводом для более прицельного изучения стероидного профиля. В ситуации с нашей пациенткой диагноз 21-гидроксилазной недостаточности был поставлен под сомнение лишь в возрасте 13 лет, когда у ее новорожденного младшего брата были выявлены нарушения формирования наружных гениталий.

Окончательно подтвердить диагноз возможно с помощью молекулярно-генетического исследования. На данный момент известно более 37 мутаций в гене HSD3B2 [19]. Мутация W230X, обнаруженная нами, описывается в литературе впервые.

Лечение недостаточности Зр-ГСД включает в себя терапию глюко- и минералокортикоидами (при сольтеряющих формах) для компенсации водно-солевого баланса, подавления уровня АКТГ и нормализации выработки андрогенов. Недостаточная конвертация ДГЭА в тестостерон у мальчиков, как правило, требует заместительной терапии андрогенами [5]. Несмотря на возрастание андрогени- зации в пубертатном периоде (за счет большей активности периферической 30-ГСД 1-го типа в этом возрасте) [14], уровень тестостерона, как правило, остается недостаточным для взрослого мужчины, что также требует назначения препаратов тестостерона. У девочек к пубертатному возрасту обычно формируются клинические и гормональные симптомы первичной эстрогеновой недостаточности и также требуется заместительная терапия половыми гормонами [5]. У описанной нами больной отмечался самостоятельный пубертат, однако сохранились нарушенный менструальный цикл, а также признаки гиперандрогении (гирсутизм, акне) и спкя.

Описанные в литературе случаи ведения больных с недостаточностью 30-ГСД в пубертатном и постпубертатном периоде отличаются вариабельностью клинической симптоматики. У женщин, как правило, половое развитие запускается самостоятельно и не требует дополнительной медикаментозной стимуляции, часто отмечается преждевременное адренархе. В последующем выявляется нарушение менструального цикла, снижение уровня прогестерона, эстрогенов, отмечаются признаки поликистоза яичников. Выраженность данных симптомов сильно колеблется. Описаны также случаи гипогонадизма [21, 22]. У мужчин известны случаи как нормально протекающего пубертата с сохраненной в последующем репродуктивной функцией, так и развития азооспермии [1]. Такое разнообразие клинической симптоматики зависит не только от адекватности и своевременности подбора терапии, но и во многом от генетической основы заболевания. Доказана тесная связь между генотипом больных и фенотипическими особенностями их гонадной функции [1]. Данный факт в очередной раз подтверждает необходимость проведения молекулярного исследования, что позволяет не только верифицировать диагноз, но и сделать прогностические выводы о фертильности таких пациентов.

Таким образом, впервые в отечественной практике у 2 разнополых сибсов с клиническими проявлениями сочетанного дефицита глюко- и минералокортикоидов и ложного гермафродитизма нами была диагностирована недостаточность 30-ГСД как причина врожденного нарушения стероидогенеза. Причиной дефицита 30-ГСД в данной семье была не описанная ранее гомозиготная мутация W230X в гене HSD3B2. Данное наблюдение подчеркивает необходимость дифференциальной диагностики с дефицитом 30-ГСД у пациентов с нетипичными проявлениями ВДКН, особенно при ее сочетании с синдромом ложного мужского гермафродитизма. Учитывая отсутствие доступных методов гормональной верификации уровня блока биосинтеза стероидов, ведущее место в диагностике редких форм ВДКН принадлежит молекулярно-генетическим исследованиям.