Гормональные исследования

17-ОН-прогестерон (17-ОНП) и альдостерон в сыворотке, а также АКТГ и активность ренина в плазме (АРП) определяли методами радиоиммуно- логического анализа с использованием коммерческих наборов. Определение кортизола и дегидро- эпиандростерон-сульфата (ДГЭА-С) в сыворотке проводили на хемилюминесцентном анализаторе Vitros ECi (Ortho-Clinical Diagnostics).

Молекулярно-генетические исследования

Геномную ДНК выделяли из периферических лейкоцитов с использованием стандартных методов. Учитывая высокую гомологию генов CYP11В1 и CYP11B2, первоначально амплифицировали фрагмент длиной 4085 п. н. с использованием прямого и обратного праймеров, специфичных для 5’- некодируемой области, и интрона 5 гена CYP11В2, соответственно (см. рис. 1). Полученный ампликон затем использовали в качестве матрицы для ПЦР двух фрагментов, охватывающих экзоны 1—2 (982 п. н.) и 3—5 (1212 п. н.) (см. рис. 1). Фрагмент, включающий экзоны 6—9 (1819 п. н.), амплифицировали в один этап. После электрофореза в 1% агарозном геле продукты ПЦР очищали с использованием набора PCR Purification Kit ("Promega", США), а затем секвенировали на автоматическом секвенаторе ABI PRISM Model 310 ("Applied Biosystems", США).

При проведении ПЦР и последующем секвенировании соответствующих экзонов и примыкающих участков интронов использовали следующие олигонуклеотиды (см. рис. 1):

5’-ТСС ТТС АТС ТАС СТТ TGG CTG GGG-3’, S 5’-GAG ТСС ТСС AGC TGC СТС ТСА АСС-3’, AS 5’-CAG GTC CAG AGC CAG ТТС TC-3’, IF, 5’-CAG GGC AGA TGT GCT TTT GG-3’, 2R 5’-CGA ТТС CCC TTG GGG АСА AG-3’, 3F, 5’-GGG AAG GCT GAG GGC AAC AG-3’, 5R, 5’-GTG GTC АТС AAG GTT TCA GAT c-3’, 6F, 5’-GGG CTT CCC ATG GAT CTG-3’, 7F, 5’-CCC TGG CCT TGC TAT TTG AC-3’, 9R.

Описание клинических случаев

Больной К., 2,3 года, от нормально протекавшей беременности, физиологических срочных родов. Родители состоят в близкородственном браке — троюродные брат и сестра. При рождении масса тела 3660 г, длина 53 см.

С рождения отмечались вялость, снижение аппетита, обильные срыгивания. При обследовании в возрасте 1 мес были выявлены гиперкалиемия 6,4 ммоль/л (норма 3,5—5,5 ммоль/л) и гипонатриемия 125 ммоль/л (норма 130—150 ммоль/л), на основании чего диагностирована сольтеряющая форма врожден-

Таблица 1 Данные гормонального обследования пациента К.

Примечание. * — 60 мин после стимуляции синактеном (новартис), в/в 125 мг; здесь и в табл. 2, 3: прочерк — исследование не проводилось.

ной дисфункции коры надпочечников (дефицит 21-гидроксилазы) и назначена терапия глюко- и минералокортикоидами. При динамическом наблюдении на фоне терапии обращало на себя внимание то, что при гормональных исследованиях уровень 17-ОНП всегда был на нижней границе нормы, а АРП сохранялась умеренно повышенной (5—10 нг/мл/ч). Учитывая отсутствие высоких уровней 17-ОНП, для уточнения диагноза была проведена постепенная отмена глюко- и минералокортикоидов, при этом уровень 17-ОНП сохранялся в пределах нормы, тогда как АРП увеличилась до 30 нг/мл/ч.

С целью уточнения диагноза в возрасте 1,3 года мальчик был обследован в детском отделении Эндокринологического научного центра. По данным объективного осмотра при поступлении: рост — 80 см (SDS 0,5), масса тела — 11,2 кг (SDS 0,75); тоны сердца ясные, шумов нет, ЧСС 120 в 1 мин, АД 80/60 мм рт. ст.; щитовидная железа не увеличена, клинически эутиреоз; гиперпигментации нет. Половое развитие: Tanner 1, яички в мошонке, объем 1 мл. Данные гормонального обследования представлены в табл. 1.

На основании полученных выше данных дефицит 21-гидроксилазы был исключен, однако обращала на себя внимание высокая АРП в сочетании с пониженным уровнем альдостерона, что позволило предположить изолированный дефицит минералокортикоидов.

Секвенирование гена CYP11В2 у пациента выявило гомозиготную мутацию. В экзоне 3 обнаружена замена С на Т в кодоне глутамина (CAG) в положении 178, в результате которой образуется стоп-кодон TAG (Q178X). У обоих родителей данная мутация выявлялась в гетерозиготном состоянии (рис. 2, см. на вклейке).

Больной А., 1 год, от 5-й беременности (1, 2-я беременности — медицинские аборты; 3-я — девочка 5 лет, здорова; 4-я — выкидыш), протекавшей с угрозой прерывания в Ill триместре, нефропатией, 2-х родов на 42-й неделе с первичной слабостью родовой деятельности. При рождении масса тела 4780 г, длина 55 см. С первых дней жизни ребенок сосал вяло, недостаточно увеличивалась масса тела, отмечалась склонность к жидкому стулу. В возрасте 2 мес был госпитализирован с явлениями прогрессирующей слабости, отсутствием аппетита, жидким стулом. В результате обследования выявлены гиперкалиемия 6,6—5,8 ммоль/л, гипонатриемия 127—135 ммоль/л, нормальные базальные уровни 17-ОНП-6.48 нмоль/л, кортизола — 651 нмоль/л и тестостерона — 0,069 нмоль/л. На основании клинической картины синдрома потери соли и электролитных нарушений была заподозрена врожденная дисфункция коры надпочечников, сольтеряющая форма. Назначена терапия кор- тефом в дозе 2,5 мг/сут, кортинеффом 0,05 мг/сут, на фоне которой отмечалась положительная динамика в виде увеличения массы тела, нормализация аппетита и стула. Однако, несмотря на малую дозу кортефа, у ребенка вскоре были отмечены клинические признаки передозировки глюкокортикоидов, что в сочетании с нормальными показателями уровня 17-ОНП (до лечения 6,48 нмоль/л, на фоне лечения 2,9 нмоль/л) и отсутствием частых мутаций в гене CYP21 вызвало сомнения в правильности ранее установленного диагноза. В этой связи кортеф был отменен, а доза кортинеффа увеличена. При этом значения уровня 17-ОНП оставались стабильно нормальными (1,6—2,9 нмоль/л), а показатели АРП — высокими (50,1—40,8 нг/мл/ч).

При первом обследовании ребенка в ЭНЦ Росмедтехноло- гий в возрасте 5 мес его рост составлял 62 см (SDS —2,63), масса — 6800 г, (SD ИМТ 0,4). По органам патологии не выявлено, АД 80/50 мм рт. ст. Щитовидная железа не увеличена, клинически эутиреоз. Гиперпигментации нет. Половое развитие: Таннер 1, яички в мошонке, объем 1 мл.

Учитывая отсутствие высоких уровней 17-ОНП, для уточнения диагноза была предпринята попытка постепенной отмены минералокортикоидов (табл. 2).

Однако уже при приеме 0,025 мг кортинеффа появились частые срыгивания, в связи с чем доза была вновь увеличена до 0,05 мг. На основании полученных выше данных дефицит 21- гидроксилазы был исключен, однако обращала на себя внимание высокая АРП, что позволило предположить изолированный дефицит минералокортикоидов.

Секвенирование гена CYP11В2 у пациента выявило составную гетерозиготность по двум мутациям: в экзоне 3 обнаружена замена С на Т в кодоне треонина (АСС) в положении 185 с образованием кодона изолейцина АТС (T185I), в экзоне 5 была обнаружена замена Т на С в кодоне лейцина (CTG) в положении 299 с образованием кодона пролина CCG (L299P). Мутация T185I в гетерозиготном состоянии была выявлена у отца, а мутация L299P — у матери ребенка (рис. 3, см. на вклейке).

Данные дальнейшего динамического наблюдения представлены в табл. 3.

Первое упоминание об изолированной минералокортикоидной недостаточности принадлежит Р. Royer и соавт., которые в 1961 г. описали семейный вариант хронического гипоальдостеронизма с дебютом в неонатальном периоде [10]. Спустя 3 года S. Ulick и соавт. [11] описали спорадический случай дефекта биосинтеза альдостерона L. Pascoe и соавт. при обследовании семьи с дефицитом альдостеронсинтазы впервые идентифицировали мутации в гене CYP11B2 [6].

Клинически дефицит альдостеронсинтазы проявляется синдромом потери соли, манифестирующим в большинстве случаев в течение первых 2 нед жизни. Заболевание характеризуется срыгиваниями, потерей массы тела, вялостью, гипотонией, гипонатриемией и гиперкалиемией. При прогрессировании состояния развивается сосудистый коллапс. Неспецифичность симптоматики (рвота, потеря массы тела, вялость, гипотония) диктует необходимость проведения дифференциальной диагностики с пилоростенозом и различными формами врожденного гипокортицизма. В первом случае диагноз может быть заподозрен на основании выявления гипокалиемии и метаболического алкалоза, что нехарактерно для синдрома потери соли. Дифференциальная диагностика с состояниями, протекающими с сочетанным дефицитом глюко- и минералокортикоидов, требуют детального гормонального обследования. Повышенная АРП при сниженном уровне альдостерона и сохранной глюкокортикоидной функции надпочечников (как было показано у 1-го пациента при проведении пробы с синактеном) позволяют заподозрить наличие изолированного дефицита альдостерона.

Несмотря на то что дефицит альдостеронсинтазы, особенно у детей раннего возраста, может представлять собой угрозу для жизни, проявления синдрома потери соли, как правило, выражены при данном заболевании не столь значительно и не прогрессируют столь стремительно, как при сочетанной недостаточности глюко- и минералокортикоидов (например, дефиците 21-гидроксилазы), что объясняется сохранным синтезом кортизола и предшественников минералокортикоидов, прежде всего дезоксикортикостерона [12]. В ряде случаев даже у детей первых лет жизни заболевание проявляется лишь недостаточным увеличением массы тела и замедлением роста. Характерной особенностью течения заболевания является то, что с возрастом оно переходит в асимптоматическую форму [9]. Возможно, это связано с тем, что в процессе постнатального созревания почки и увеличения потребления соли в пищу происходит уменьшение потребности в альдостероне. В этой связи представляет интерес описание случая дефицита альдостеронсинтазы у мужчины в возрасте 47 лет, заподозренного на основании гиперкалиемии, значительного повышения АРП и низкого уровня альдостерона, подтвержденного выявлением мутации в гене CYP11B2 (гомозиготное удвоение 6 нуклеотидов в кодоне 143 экзоне 3, приведшее к вставке двух дополнительных кодонов аргинина и лейцина) [3]. В эксперименте in vitro данная мутация проявлялась полной потерей ферментативной активности. Подробный анамнез жизни пациента выявил, что с 1 до И мес жизни у него были частые рвоты (что связывали с пилороспазмом), масса тела не увеличивалась и к году составляла всего 5,5 кг. Его родители были троюродными братом и сестрой. Приведенный клинический пример является пока единственным описанием случая декомпенсации минералокортикоидной недостаточности у взрослого человека, которая была спровоцирована сопутствующим заболеванием, приведшим к потере электролитов.

Таблица 3. Данные динамического наблюдения пациента А.

Первоначально лабораторная верификация дефицита Р450 aldo была основана на определении соотношения концентраций альдостерона и его предшественников в плазме и (или) метаболитов минералокортикоидов в моче. В связи с этим было принято выделять две формы заболевания: дефицит альдостеронсинтазы I и II типов. При типе I уровень альдостерона будет значительно снижен, вплоть до неопределяемого, в сочетании с повышенным уровнем 18-гидрокси-11-дезоксикортикостерона (18-ОНДОК) и повышенным соотношением кортикостерон/18-гидроксикортикосте- рон (В/18-ОНВ). При типе II уровень альдостерона может быть в пределах нижней границы нормы, уровни 18-ОНВ и 18-ОНДОК будут повышены, также как и соотношение 18-ОНВ/альдостерон. Однако при обоих типах заболевание связано с дефектом в гене CYP11В2. Как показано в экспериментах in vitro, при дефиците СМО I чаще встречаются мутации, приводящие к значительному снижению всех трех ферментативных активностей Р450 aldo — делеция 5 нуклеотидов в экзоне 1, Е255Х, R384P [2, 4], тогда как при дефиците СМО II (более легкая форма заболевания) 11р-гидрокси- лазная активность фермента сохранена, и мутации, описанные при дефиците СМО II, например E198D, V386A, Т318М, действительно имеют частичную ферментативную активность in vitro [1, 6, 8, 14]. Однако в последнее время не все авторы соглашаются с разграничением на формы, указывая на то, что, во-первых, не всегда возможно по биохимическим маркерам четко разграничить две формы [13] и, во-вторых, не всегда выявляется фенотип- генотипическая корреляция [7].

Таким образом, впервые в отечественной литературе нами описаны случаи изолированной минералокортикоидной недостаточности. Причиной заболевания является дефицит фермента альдостеронсинтазы, что было доказано при идентификации неизвестной ранее гомозиготной мутации Q178X в гене CYP11В2 у одного пациента и составной гетерозиготной мутации T185I/L299P — у другого. Данное наблюдение расширяет наши представления о наследственных вариантах нарушения биосинтеза кортикостероидов и подчеркивает необходимость включения изолированного дефицита альдостерона в спектр нозологий при дифференциальной диагностике синдрома потери соли.