Ожирение сопровождается накоплением макрофагов в ЖТ. У животных и у людей установлена корреляция выраженности ожирения и количества макрофагов в ЖТ [8, 32]. У лиц с очень большим избытком массы тела макрофаги могут составлять до 40% всех клеток ЖТ [64]. Клеточная инфильтрация больше выражена в висцеральной жировой ткани, чем в подкожной [9, 55]. Также выявлено, что количество макрофагов существенно увеличивается в период накопления жира с быстрым повышением массы тела [48]. Эти результаты позволяют предположить, что как острая, так и хроническая перегрузка липидами усиливает инфильтрацию ЖТ макрофагами, т. е. усиливает воспалительную реакцию. Снижение массы тела сопровождается уменьшением выраженности воспалительного процесса в ЖТ [13] и коррелирует с уменьшением инфильтрации ткани макрофагами [10].

Морфологические исследования показали, что макрофаги в ЖТ локализуются преимущественно вокруг гипертрофированных и/или погибших адипоцитов, образуя характерную, так называемую венцеобразную, структуру [46]. Полагают, что до 90% всех макрофагов ЖТ организовано в пределах этих структур [46], причем большая часть этих макрофагов относится к фенотипу Ml, обладающему провоспалительными свойствами [46]. Учитывая накопление макрофагов вокруг погибших адипоцитов, было высказано предположение, что одной из функций макрофагов является индукция апоптоза измененных жировых клеток [12]. В процессе апоптоза адипоцитов примерно половина макрофагов, локализованных в венцеобразной структуре, окружающей жировую клетку, погибает [46]. Точный механизм гибели макрофагов неизвестен. Предполагают, что после того как макрофаги поглотили некротизированные адипоциты, они сами разрушаются и тем самым поддерживают воспалительную реакцию.

При ожирении кроме макрофагов в ЖТ встречаются, хотя и в меньших количествах, нейтрофилы [5] и Т-лимфоциты [37]. Сравнивая клеточный состав ЖТ у мышей в различные периоды после начала кормления их пищей, индуцирующей ожирение, установлено, что проникновение в ЖТ нейтрофилов и Т-лимфоцитов на 3—7 дней опережает инфильтрацию макрофагами [17, 37]. Поэтапная инфильтрация ткани — вначале нейтрофилами и Т- лимфоцитами, в последующем — макрофагами, описывается как характерное проявление любого воспалительного процесса.

При изучении иммунологических реакций в различных органах и тканях выявлены два фенотипа макрофагов: провоспалительные, активированные классическим путем (Ml), и противовоспалительные, альтернативно активированные (М2). При ожирении в ЖТ определяются оба фенотипа [6, 32]. У мышей на фоне питания избыточной калорийности и увеличения массы тела наблюдается, с одной стороны, дальнейший рост общего количества макрофагов в ЖТ, с другой — увеличение доли макрофагов фенотипа Ml [41]. У больных с ожирением [30] или СД2 [37] также преобладали макрофаги фенотипа М1. Кроме лечения росиглитазоном, уменьшающим инсулинорезистентность [62], происходит сдвиг от фенотипа Ml к М2 [58]. Примечательно, что при сохранении сдвига фенотипа макрофагов в сторону М1 сохраняется инсулинорезистентность (ИР), а также усиливаются липолиз в адипоцитах и накопление липидов в печеночных клетках [36].

Одним из эффектов макрофагов в ЖТ является их угнетающее влияние на преобразование преадипоцитов в зрелые адипоциты [14]. В результате тормозится гиперплазия ЖТ, число адипоцитов не увеличивается. В этих условиях нагрузка липидами ведет к гипертрофии имеющихся адипоцитов. У мышей с ожирением показана прямая корреляция между размерами адипоцитов и количеством макрофагов в ЖТ [46]. Гипертрофия адипоцитов при ожирении — давно известный факт и, как полагают, одна из причин метаболических и секреторных нарушений ЖТ. Вследствие угнетения дифференцировки преадипоциты по своим характеристикам становятся похожими на стромальные клетки ЖТ и приобретают способность продуцировать элементы ЭЦМ [48], что может способствовать развитию фиброза ЖТ при ожирении.

Также установлено стимулирующее влияние макрофагов ЖТ на ангиогенез [51]. Это действие реализуется путем усиления экспрессии макрофагами фактора ангиогенеза PDGF (platelet-derived growth factor), который регулирует формирование эндотелиальных клеток.

ВЖТ начинается с проникновения моноцитов из кровеносного русла в ЖТ и их трансформацией в макрофаги. Миграция лейкоцитов из кровотока в ткани наблюдается при каждом воспалительном процессе в ответ на повреждающие стимулы [39], преимущественно в мелких сосудах, на уровне микроциркуляции [27]. Миграция лейкоцитов контролируется их взаимодействием с эндотелиальными клетками и протекает в следующей последовательности: связывание с адгезивными молекулами, перекатывание (роллинг), активация, прикрепление лейкоцитов к стенке сосуда и экстравазация. Решающая роль в этом процессе принадлежит молекулам адгезии, которые экспрессируются на поверхности как лейкоцитов, так и эндотелиальных клеток [3]. Нестимулирован- ные лейкоциты в отсутствие адгезивных молекул не реагируют с сосудистой стенкой. Протеины семейства се- лектинов (Р-селектин и Е-селектин) обеспечивают первичную активацию лейкоцитов [3], перекатывание (роллинг) лейкоцитов к эндотелию и их связывание с адгезивными молекулами ICAM (intercellular adhesion molecule) и VCAM (vascular cell adhesion molecule), локализованными на поверхности эндотелиальных клеток. Затем, с участием РЕСАМ-1 (platelet/endothelial cell adhesion

45 molecule-1), лейкоциты инфильтруют внесосудистое пространство. Молекулы РЕСАМ-1 локализуются на боковых мембранах эндотелиальных клеток, т. е. именно там, где лейкоциты проникают из сосудистого русла в ЖТ. Движение лейкоцитов определяется градиентом РЕСАМ-1, концентрация которого возрастает по направлению к экстравазальному пространству. У лиц с ожирением повышен уровень в крови перечисленных участников реакции адгезии — ICAM, VCAM, Р- и Е-селектина [44]. Повышение уровня молекул адгезии указывает на активацию взаимодействия лейкоцитов и эндотелия при ожирении. Высокоразрешающая лазерная микроскопия особенно убедительно продемонстрировала активацию этого взаимодействия при ожирении в опытах на живых мышах при непосредственном динамическом наблюдении процесса прикрепления лейкоцитов к эндотелию и их перемещения в ЖТ [48].

Поскольку выраженность ВЖТ прямо коррелирует со степенью ожирения и увеличивается при избыточном поступлении липидов, то напрашивается вывод, что эти факторы являются причиной ВЖТ. Довольно рано было обнаружено, что при ожирении адипоциты продуцируют в повышенных количествах хемокины [35], ответственные за адгезию моноцитов и их трансформацию в макрофаги. Наибольшее значение придается МСР-1 (monocyte chemoattractant protein-1), известному также как CCL2 (chemokine ligand-2). Позже было установлено [32], что ЖТ у лиц с ожирением продуцирует довольно много различных хемокинов (CCL2, CCL3, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11), а также экспрессирует рецепторы хемокинов (CCR1, CCR2, CCR3, CCR5). Проблема осложнилась открытием секреции хемокинов и их рецепторов макрофагами ЖТ [44]. При этом оказалось, что они преимущественно продуцируются макрофагами фенотипа Ml, обладающими провоспалительными свойствами [3]. Стало ясно, что ВЖТ — процесс самоподдерживающий- ся: макрофаги ЖТ стимулируют проникновение новых моноцитов/макрофагов. С учетом того, что макрофаги способствуют гипертрофии адипоцитов, которые, в свою очередь, в повышенных количествах экспрессируют хемокины и их рецепторы, следует признать, что при ожирении имеется порочный круг с положительной обратной связью: гипертрофированные адипоциты продуцируют хемокины и их рецепторы, которые инициируют рекрутирование моноцитов/макрофагов; последние способствуют дальнейшему увеличению гипертрофии адипоцитов и, кроме того, вырабатывают протеины адгезии, что в итоге ведет к дальнейшему нарастанию воспалительной реакции.

Гипотезу о наличии подобного порочного круга подтверждают данные о тесном взаимодействии макрофагов и адипоцитов, определяющем функциональное состояние обоих видов клеток [12, 41,59]. In vitro показано, что секреторные продукты адипоцитов усиливают секрецию воспалительных цитокинов макрофагами. Эти данные были подтверждены исследованиями in vivo. Оказалось, что энзиматическая аблация адипоцитов у крыс увеличивает уровень интерлейкина-6 (ИЛ-6) при стимуляции липополисахаридом. Если инактивировать специфические для адипоцитов протеины, связывающие жирные кислоты, то это ведет к уменьшению секреции воспалительных цитокинов в макрофагах. Инактивация этих же протеинов, связывающих жирные кислоты в макрофагах, ведет к усилению сигнального пути инсулина и усвоения глюкозы в адипоцитах [24]. С другой стороны, синтезируемые макрофагами цитокины меняют метаболическую и секреторную функцию адипоцитов. Наиболее детально изученный цитокин — фактор некроза опухоли а (ФНОа) стимулирует в адипоцитах секрецию лептина, угнетает экспрессию адипонектина, а также приводит к ИР жировых клеток и усилению липолиза. Во взаимодействии макрофагов и адипоцитов участвует фактор транскрипции PPARa. Оказалось, что лиганды PPARa уменьшают экспрессию хемокина МСР-1 и цитокина ФНОа как в адипоцитах, так и в макрофагах, что в итоге уменьшает выраженность ВЖТ [62].

Одним из важных элементов воспалительного процесса является нарушение микроциркуляции. При ожирении установлено уменьшение кровотока в ЖТ: снижено количество крови, протекающей в определенном объеме ткани в единицу времени [34, 56]. Методом динамического наблюдения лазерным микроскопом в ЖТ у живых мышей при ожирении подтверждено замедление кровотока [48]. Причины нарушения микроциркуляции до конца не ясны. Нарушения реологических свойств крови при замедлении кровотока в ЖТ не обнаруживались, и они как причинный фактор исключены [48]. Постулируется значение изменения функциональных свойств сосудистой стенки. В пользу такого предположения свидетельствует факт повышения проницаемости стенки сосудов ЖТ при ожирении [48]. Интересно, что по мере роста ЖТ усиливается фенестрация капилляров, что является предпосылкой для повышения проницаемости сосудов.

Замедление кровотока постулируется как фактор ишемии, способствующий развитию метаболической дисфункции ЖТ, ведущей к повышению риска ССЗ [60]. Гипоксия ЖТ была продемонстрирована непосредственными измерениями, а также опосредованно, на основании повышения содержания в ткани маркеров гипоксии (транскрипционный фактор, фактор-1а). Гипоксия адипоцитов грызунов и человека приводила к стимуляции экспрессии провоспалительных адипокинов: ИЛ-6, лептина, фактора ингибиции миграции макрофагов, фактора роста васкулярного эндотелия. Гипоксия также стимулировала воспалительную реакцию макрофагов и тормозила дифференцировку преадипоцитов в зрелые адипоциты. В адипоцитах человека гипоксия повышала экспрессию GLUT4, уровень протеина и транспорт глюкозы, что свидетельствует о стимуляции утилизации глюкозы жировыми клетками в условиях недостатка кислорода. Сделан вывод, что гипоксия меняет метаболизм адипоцитов и функциональное состояние ЖТ в целом, поддерживает воспалительный процесс и способствует развитию заболеваний, связанных с ожирением: в первую очередь атеросклероза и СД2 [63].

При ВЖТ у людей и животных различными методами установлена эндотелиальная дисфункция [7]. Установлена прямая корреляция между количеством макрофагов в ЖТ и степенью нарушения зависимой от эндотелия дилатации сосудов [48]. Причинами эндотелиальной дисфункции могут быть метаболические расстройства. ВЖТ ассоциируется с гипертонией, низким уровнем липопротеидов высокой плотности, высоким — липопротеидов низкой плотности, гипертриглицеридемии; увеличением продукции жирных кислот и свободных радикалов, повышенной секрецией ингибитора активатора плазминогена-1 (ИАП-1) [38, 42, 43, 57]. Многие адипокины, продукция которых меняется при ВЖТ, способствуют развитию эндотелиальной дисфункции [21, 45, 52]. В свою очередь эндотелиальная дисфункция, как известно, является фактором, инициирующим атеросклероз. Следовательно, ВЖТ можно рассматривать как связующее звено между ожирением и атеросклерозом.

Хронический воспалительный процесс в большинстве тканей приводит к развитию фиброза. Увеличивается число соединительнотканных клеток и количество ЭЦМ. Этот же процесс наблюдается в ЖТ при ожирении. Усиление интерстициального фиброза ЖТ при ожирении описано у детей [54] и взрослых [29]. Методом электронной микроскопии показано, что фиброзный материал локализуется в виде аморфной зоны вокруг адипоцитов, что расценивается как признак повреждения ткани [48].

В развитии фиброза в ЖТ ведущее значение отводится преадипоцитам. Количественное определение источников ЭЦМ показало, что около 70% ЭЦМ продуцируется адипоцитами. Культура клеток преадипоцитов, полученных из ЖТ людей с ожирением, под влиянием активированных макрофагов продуцирует все основные компоненты ЭЦМ: структурные протеины, включая коллаген (преимущественно I типа) и предшественники коллагена, адгезирующие протеины (фибронектин-1 и его рецепторы), а также ламинины (гликозаминогликаны, протеогликаны). При этом в ЭЦМ наблюдалась активация таких ферментов, как металлопротеазы и гидроксилаза, участвующих в синтезе и деградации коллагена. Примечательно, что снижение массы тела в результате хирургического лечения больных с ожирением приводило к уменьшению системных параметров воспаления (уровня СРБ, фибриногена, лейкоцитов) и инфильтрации ЖТ макрофагами, но не снижало степень фиброза ЖТ [29]. Следовательно, ВЖТ приводит к необратимым структурным, фибротическим изменениям ЖТ.

По-видимому, фиброз ЖТ мало отличается от фиброза других органов и тканей и имеет те же патофизиологические характеристики. Необратимость фибротиче- ских изменений, несмотря на уменьшение выраженности патологического процесса, — известный биологический феномен, который особенно хорошо документирован для печени [53]. Развитие фиброза ЖТ и его ирре- версибельность в определенной степени объясняют безуспешность терапии ожирения у части больных, несмотря на адекватность проводимого лечения.

ЖТ является эндокринным органом, секретирующим ряд активных молекул — адипокинов, модулирующих метаболические и иммунные процессы локально в самой ЖТ, в других органах (в первую очередь в печени, мышцах и сосудах), а также на системном уровне. ВЖТ при ожирении сопровождается повышением секреции лептина, резистина, адипсина, ИАП-1, апелина, оментина, васпина, ретинолсвязывающего протеина-4, компонентов ренин-ангиотензиновой системы, таких провоспали- тельных цитокинов, как ФНОа, ИЛ-6, ИЛ-1, а также хемокинов. Секреция адипонектина при ВЖТ, наоборот, снижена. Физиологическое и патофизиологическое значение основных адипокинов описано нами ранее [1]. Здесь мы коснемся лишь изменений, связанных с ВЖТ.

Сдвиги секреции адипокинов, несомненно, способствуют развитию ВЖТ. Однако изменения продукции адипокинов — не столько причина, сколько следствие ВЖТ. Разграничить источники повышенной продукции цитокинов — адипоциты или макрофаги — пока не представляется возможным. Исследование культуры клеток, полученной у лиц с ожирением, показывает усиление секреции цитокинов как изолированными адипоцитами, так и макрофагами [16]. Причем в ЖТ, особенно в висцеральном жире, концентрация некоторых цитокинов (ФНОа, ИЛ-6) более чем в 100 раз выше, чем в циркулирующей крови [22]. Это привело к заключению, что цитокины реализуют свое действие преимущественно не эндокринным, а паракринным путем. Также имеются данные об аутокринном действии этих провоспалительных цитокинов.

Наиболее известным и значимым цитокином, несомненно, является ФНОа. Результаты последних исследований показывают, что большая часть ФНОа ЖТ продуцируется макрофагами [31] и лишь ограниченное количество — адипоцитами. Его действие при ожирении и ВЖТ весьма многогранно. ФНОа стимулирует в макрофагах и эндотелиальных клетках секрецию других цитокинов, усиливает экспрессию адгезивных молекул на поверхности клеток, что обусловливает воспалительную инфильтрацию тканей, активирует метаболизм арахидоновой кислоты (соответственно продукцию простагландинов и тромбоксана, что в итоге приводит к повреждению сосудов и тромбообразованию). ФНОа стимулирует в адипоцитах и макрофагах секрецию хемокина МСР-1 [65], что также усиливает инфильтрацию ЖТ воспалительными клетками.

В эндотелиальных клетках ФНОа уменьшает образование оксида азота, что, в свою очередь, угнетает дилатацию сосудов и способствует дисфункции эндотелия [30]. У больных гипертонией выявлена тесная коррелятивная связь функционального состояния эндотелия и содержания ФНОа и ИЛ-6 в крови [47]. Роль ФНОа в развитии нарушений функционального состояния сосудистой системы демонстрируется применением ингибиторов этого цитокина. Антитела к ФНОа у больных ревматоидным артритом уменьшали эндотелиальную дисфункцию и показатели воспаления [4].

ФНОа, по-видимому, является одним из факторов, реализующих угнетающее действие макрофагов на дифференцировку преадипоцитов в зрелые адипоциты.

Соответственно ФНОа может способствовать развитию гипертрофии адипоцитов и дальнейшему ожирению, а также стимулировать фиброз ЖТ. ФНОа также можно признать медиатором, который делает ВЖТ самоподдер- живающимся процессом. Наконец, ФНОа активирует внутриклеточные пути воспалительной реакции. В частности, ФНОа активирует сигнальные пути, включающие Ikp (Inhibitor of kappa В), IKKp (Ikp Kinasep), NF-кВ (Nuclear Factor-kappa В), что приводит к индукции секреции и экспрессии молекул адгезии, а также повышает содержание в клетках реактивных форм кислорода.

К детально изученным адипокинам относится также лептин. Он синтезируется практически только жировыми клетками, угнетает аппетит и прием пищи, воздействуя на рецепторы гипоталамуса. В условиях ожирения физиологические эффекты лептина не проявляются, что связано с развитием лептинрезистентности. Лептинрезистентность, несмотря на повышенный уровень лептина, обусловливает дальнейшее прогрессирование ожирения. Помимо регуляции энергетического баланса лептин способен активировать такие воспалительные клетки, как макрофаги, нейтрофильные гранулоциты, Т-лимфоциты, а также стимулировать секрецию цитокинов этими клетками [20, 21]. Следовательно, повышенная секреция лептина при ожирении способствует развитию воспалительной реакции.

Адипонектин, в отличие от большинства других адипокинов, оказывает протективное действие. Он синтезируется в основном жировыми клетками, и его функция заключается в снижении гликемии и внутриклеточного уровня триглицеридов. Эти эффекты обусловливают повышение чувствительности тканей к инсулину. При состояниях, сопровождающихся воспалительной реакцией ЖТ, секреция адипонектина снижена. Низкая секреция адипонектина коррелирует с повышенным содержанием СРБ в крови [18]. Адипонектин снижает секрецию ФНОа, ИЛ-6, а также хемокинов [11]. Кроме того, на изолированных клетках продемонстрировано угнетающее влияние адипонектина на фактор транскрипции NF-kB [28, 50], обязательного участника воспалительной реакции. Снижение секреции адипонектина при ожирении ведет к уменьшению указанного угнетающего влияния на NF-кВ и тем самым может способствовать воспалению. Совокупность этих сдвигов объясняет противовоспалительное действие адипонектина. Причинно-следственная связь воспаления и гипоадипонектинемии при ожирении остается неясной. Вероятнее всего, эти состояния по принципу прямой обратной связи усугубляют друг друга и образуют порочный замкнутый круг.

47

В развитии воспалительной реакции также играют роль свободные жирные кислоты (СЖК), уровень которых при ожирении повышается в результате активации процесса липолиза в адипоцитах. СЖК воздействуют на воспалительные киназы JNK (c-Jun N-terminale Kinase) и IKKp и, тем самым, активируют фактор транскрипции NF-кВ. У грызунов СЖК в мышечных клетках активируют протеинкиназу-С (ПК-С), которая также способствует активации NF-кВ. Внутривенная инфузия липидов приводила у крыс к активации ПК-С, IKKp и NF-кВ [26, 33]. Следовательно, повышенный уровень СЖК способствует развитию воспалительной реакции, по-видимому, преимущественно за счет активации фактора транскрипции.

Воспалительная реакция всегда сопровождается оксида- тивным стрессом. Оксидативный стресс определяется как нарушение соотношения между продукцией реактивных форм кислорода и антиоксидантными защитными факторами. При ВЖТ больше исследованы последствия накопления реактивных форм кислорода, в частности, супероксида. Последний образуется при активации фермента ни- котинамид-динуклеотидфосфат (НАДФ)-оксидазы, которая локализуется на мембранах митохондрий [19, 49]. В макрофагах супероксид образуется в больших количествах, чем в адипоцитах [2]. Кроме того, его выделяют нейтрофилы, фибробласты, эндотелиальные и гладкомышечные клетки сосудов [25]. Освобождающийся супероксид, и, возможно, другие реактивные формы кислорода активируют ряд внутриклеточных киназ: JNK, ПК-С, р38 MARK, IKKp. Эти киназы выявляются практически во всех типах клеток, включая адипоциты и макрофаги. Активация указанных киназ стимулирует экспрессию таких провоспали- тельных медиаторов, как ФНОос, ИЛ-6, МСР-1. Примечательно, что последние, действуя локально или системно, стимулируют дальнейшее образование реактивных форм кислорода [40]. Тем самым формируется петля обратной позитивной связи, процесс приобретает характер самопод- держивающегося с тенденцией к прогрессированию. Активация ПК-С определяет регуляцию и активацию НАДФ- оксидазы и ведет к продукции супероксида, в то время как активация IKKp через ряд промежуточных субстанций в итоге ведет к генерации NF-кВ, важнейшего фактора транскрипции, который контролирует НАДФ-оксидазу, многие воспалительные цитокины и такие адгезивные молекулы, как ICAM-1 и VCAM-1 [15]. Реактивные формы кислорода влияют на функциональное состояние этих адгезивных молекул и таким путем могут усиливать клеточную инфильтрацию ЖТ и нарушать функциональное состояние эндотелия [61].

Данные, полученные различными исследовательскими группами, не оставляют сомнений в том, что при ожирении наблюдаются воспалительные реакции в ЖТ. Выраженность этого воспаления довольно строго коррелирует со степенью ожирения. Фактором, который инициирует ВЖТ, скорее всего является острая и/или хроническая нагрузка липидами. При этом в ЖТ наблюдаются изменения, которые присущи воспалительной реакции независимо от причины и локализации: начальная инфильтрация нейтрофилами и лимфоцитами, несколько позже макрофагами, которые доминируют количественно и определяют дальнейшее развитие процесса. Секретирующиеся клетками ЖТ хемокины и адгезивные молекулы способствуют воспалительной клеточной инфильтрации. Сосудистая реакция и изменения эндотелия при ВЖТ также не имеют принципиальных отличий от воспалительных изменений в других органах. Весьма важным является открытие развития фиброза ЖТ при ожирении. Это подчеркивает, что воспаление в ЖТ имеет следствием необратимые структурные перестройки, обусловливающие чрезвычайные трудности лечения и выдвигающие на первый план необходимость профилактических мероприятий.

На основании соответствия воспалительного процесса в ЖТ общепатологическим закономерностям мы правомочны определять ожирение как хроническое воспалительное заболевание. При этом ВЖТ — процесс само- подерживающийся, способствующий дальнейшему развитию и прогрессированию как воспаления, так и ожирения. Причем его механизмы весьма разнообразны и осуществляются на уровне тканевых, клеточных и внутриклеточных механизмов.

Однако ВЖТ имеет принципиальные отличия, обусловленные особенностью ЖТ. Воспалительная реакция реализуется в ткани, доля которой может составлять 50% массы тела и более, и уже в силу этого следует ожидать системных последствий. С другой стороны, ЖТ представляет собой активнейший эндокринный и метаболический орган. Изменения секреции адипокинов, сдвиги в жировом и углеводном обмене способствуют развитию атеросклероза, артериальной гипертонии, СД-2, МС. ВЖТ следует признать связующим звеном между этими заболеваниями и ожирением.

Лечение и профилактика ожирения сегодня проводятся без учета ВЖТ. Однако роль ВЖТ в патогенезе ожирения и связанных с ним заболеваний, решающим образом сказывающихся на продолжительности жизни и структуре смертности, определяет важность и перспективность поиска методов воздействия на воспалительный процесс в ЖТ.