Опыты выполнены на белых беспородных крысах-самцах массой тела 180—220 г. Все животные находились на обычном пищевом рационе и перед опытом голодали в течение 18—24 ч, воду получали без ограничения. Гипогликемическую кому (концентрация глюкозы в крови около 1 мМ/л, утрата постуральных рефлексов) вызывали внутримышечной инъекцией 40 ЕД инсулина на 1 кг массы тела. Купирование комы осуществляли введением 3 мл 40% раствора глюкозы в желудок.

Интенсивность накопления МДА в гомогенатах мозга крыс, перенесших 7—9 гипогликемических ком, при добавлении Fe2+ и аскорбата (7) и в отсутствие Fe2+ и аскорбата (/7), а также у крыс в состоянии гипогликемической комы в присутствии Fe2+ и аскорбата (/77).

И — исходный уровень; 30, 60, 120 — время инкубации (в мин). Треугольник — контроль; кружок — опыт. Звездочкой обозначены статистически достоверные изменения (р < 0,05).

Таблица 1

Уровень ДК (в Е232 • 1000/мг ткани), активность СОД (в ЕД/мг белка) и НАДФ-зависимых дегидрогеназ (в нмоль/мин/мг белка) в мозге крыс в состоянии гипогликемической комы и через 30 мин после купирования ее глюкозой (М ± т)

Примечание. В табл. 1 и 2 звездочкой обозначены статистически достоверные изменения (р < 0,05); в каждой серии по 5—6 опытов.

Исследовали ткани больших полушарий (БП) и ствола мозга (СТ) крыс, находящихся в состоянии гипогликемической комы, через 30 мин после купирования однократной комы и животных, перенесших 7—9 гипогликемических ком с интервалом 2 дня, на 2-е сутки после последней комы. Контролем служили интактные животные.

Скорость накопления малонового диальдегида (МДА) оценивали по реакции с тиобарбитуровой кислотой после инкубации 10% гомогенатов мозга в среде (в мМ): NaCl — 132; КС1 — 5; NaH2PO4 — 1,2; MgCl2 — 1,3; СаС12 — 1,2; глюкоза — 10,0; pH 7,4 при 37°С как без добавления Fe2+ и аскорбата, так и в их присутствии в конечных концентрациях соответственно 10“5 и 2 • 10-4 М [4]. Уровень диеновых конъюгатов (ДК) определяли спектрофотометрически [ 1 ]. Активность супероксид- дисмутазы (СОД, КФ 1.15.1.11) оценивали по торможению восстановления нитросинего тетразо- лия [3].

Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ, КФ 1.1.1.49), НАДФ-малатдегидроге- назы (НАДФ-МДГ, КФ 1.1.1.40), НАДФ-изоцит- ратдегидрогеназы (НАДФ-ИЦДГ, КФ 1.1.1.42) и глутатионредуктазы (ГР, КФ 1.6.4.2) в цитоплазматической фракции исследовали спектрофотометрически [5].

Активность нейтральных и кислых протеаз определяли при pH 7,6 и 3,2 соответственно по накоплению тирозина, инкубируя гомогенаты мозга в присутствии денатурированного мочевиной гемоглобина [6]. Количество белка определяли по Лоури. Результаты экспериментов обрабатывали статистически с применением /-критерия Стьюдента.

У крыс, находящихся в состоянии гипогликемической комы, изменений скорости накопления МДА не обнаружено как при добавлении Fe2+ и аскорбата, так и в их отсутствие (см. рисунок). Изменений уровня ДК и активности ГР не выявлено. Обнаружено уменьшение активности Г-6- ФДГ на 35—53% (р < 0,01) в исследованных отделах мозга и СОД в СТ на 19% (р < 0,01) (табл. 1).

Через 30 мин после купирования гипогликемической комы изменений активности дегидрогеназ и СОД не наблюдалось, при этом увеличивался уровень ДК в СТ на 11% (р < 0,05).

У подопытных животных, перенесших 7—9 ком, на 2-е сутки после купирования последней комы в БП наблюдалось уменьшение активности Г-6-ФДГ на 9% (р < 0,05), НАДФ-ИЦДГ на 9% (р < 0,05) и ГР на 11% (р < 0,05), а в СТ - уменьшение активности НАД Ф-МД Г на 21% (р < 0,05). Активность СОД оказалась сниженной в БП и СТ соответственно на 52 и 37% (р < 0,05) (табл. 2). При этом наблюдали увеличение продукции МДА в СТ как стимулируемой Fe2+ и аскорбатом (25—30%), так и нестимулируемой (27%; р < 0,05).

Уровень ДК у крыс, подвергнутых неоднократной гиперинсулинизации, оказался сниженным в БП и СТ соответственно на 22 и 39% (в обоих случаях р < 0,05). У животных, перенесших серию гипогликемических ком, обнаружено увеличение активности нейтральных и кислых протеаз в структурах ствола мозга соответственно на 20 и 28% (в обоих случаях р < 0,05).

Увеличение скорости накопления МДА свидетельствует о стимуляции процессов ПОЛ в мозге крыс, подвергнутых многократной гиперинсулинизации. Уменьшение активности СОД и НАДФ- дегидрогеназ может быть связано с окислением сульфгидрильных групп белковой части молекул ферментов образующимися активными формами кислорода и азота [11], что в свою очередь снижает емкость антиоксидантных систем. Выявленное в данном эксперименте увеличение активности протеаз также, по-видимому, является свидетельством возникновения окислительного стресса, поскольку действие на геном продуктов ПОЛ приводит к индукции протеаз [12].

Повреждающее воздействие гипогликемии на мозг реализуется путем нарушений кальциевого гомеостаза, активации фосфалипаз и увеличения уровня ненасыщенных свободных жирных кислот [9], которые окисляются с существенно большей скоростью, чем эстерифицированные [7]. Уменьшение уровня ДК в мозге животных, перенесших серию гипогликемических ком, вероятно, обусловлено истощением пула легкомобилизуе- мых ненасыщенных высших жирных кислот в мозге крыс.

Более выраженные изменения наблюдаются в образованиях СТ. Многократное введение гипогликемических доз инсулина приводит к уменьшению интенсивности гликогенолиза в стволе мозга [8]. Высокая уязвимость структур СТ, по-видимо- му, связана с большим содержанием в них липидов и соответственно с потенциально большим количеством продуктов ПОЛ, которые способствуют уменьшению активности дегидрогеназ, СОД и индукции протеаз. С другой стороны, отделы СТ более чувствительны к окислительному повреждению, поскольку содержат большие количества ионов железа, накапливаемых меланином допаминергических нейронов и освобождаемых при неблагоприятных воздействиях на мозг [11], что, возможно, и является причиной накопления МДА в инкубате в отсутствие Fe2+ и аскорбата (см. рисунок).

Таблица 2

Уровень ДК (в Е232 * ЮОО/мг ткани), активность СОД (в ЕД/мг белка), протеаз (в мкг тирозина/ч/г ткани) и НАДФ-зависимых дегидрогеназ (в нмоль/мин/мг белка) в мозге крыс, перенесших серию гипогликемических ком (М ± т)

Таким образом, неоднократное воздействие ги- погликемиина мозг in vivo приводит к активации процессов ГГОЛ, уменьшению активности СОД и НАДФ-дегидрогеназ и индукции протеаз в отделах мозга. Выявленные изменения, по-видимому, имеют значение в патогенезе постгипогликемической энцефалопатии. Использование препаратов, защищающих нейроны от окислительного стресса, может оказаться полезным в профилактике постгипогликемической энцефалопатии при купировании гипогликемической комы и интенсивной терапии сахарного диабета.