Самцов крыс линии Вистар массой 180—200 г получали из лаборатории экспериментальных животных Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск). Анестезию проводили тиопенталом (1 мг/100 г).

Приготовление препарата ГРК. Печень крысы гомогенизировали в 5-кратном объеме ТЕ, содержащем 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1 мМ PMSF и 5% глицерин. Гомогенат центрифугировали 10 мин при 5000 g, затем супернатант центрифугировали 1 ч при 105 000 g, инкубировали в присутствии 10 нМ 3Н-триамцинолона 15 мин при 20°С и наносили на колонку mono-Q в буфере того же состава, за исключением глицерина, ГРК элюировали линейным градиентом NaCl 0,0—0,3 М. Элюент из пика специфического связывания объединяли и использовали как препарат частично очищенного ГРК. Все манипуляции, за исключением инкубации, проводили в ледяной бане.

Синтетические олигонуклеотиды с последовательностью TGTACAGGATGTTCT, соответствующей ГРЭ-1 из промотора гена тирозинаминотрансферазы крысы [10], получали из сектора синтеза Института цитологии и генетики СО РАН. Олигонуклеотиды метили 32Р с помощью Т4-концевой киназы в буфере, содержащем 50 мМ трис-НС1, pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 5 мМ DTT, 1 — 10 пМ олигонуклеотида, 50 мкКи 32Р-АТФ (1000—2000 Ки/ммоль; Санкт-Петербург), 50 мкг/мл BSA, 5 U Т4-киназы в общем объеме 6 мкл, 20 мин при 37°С. Меченые олигонуклеотиды отделяли от АТФ, меченного 32Р, с помощью гель-фильтрации на колонке Sephadex G50 SF объемом 1 мл. Продукт имел удельную радиоактивность не |{иже 1000 Ки/ммоль.

Определение констант диссоциации Кдисс. Для образования комплексов ГРК—ГРЭ, различные концентрации олигонуклеотидов инкубировали с равными количествами препарата ГРЭ (10—15 мкг белка) 10 мин при 37°С в среде, содержащей 0,1 мкг ДНК из тимуса теленка, 4% глицерин, 1 мМ DTT, 40 мМ NaCl, 0,1 мМ PMSF, 2,5 мМ MgCl2, 0,1 мМ EDTA, 10 мМ HEPES. Концентрации меченых олигонуклеотидов приводятся в подписях к соответствующим рисункам. Образцы объемом 15 мкл наносили на 12% полиакриламидный гель и проводили электрофорез в неденатурирующих условиях в 0,5 PBS с напряженностью электрического поля 13 В/см в течение 3 ч. Гели авто- радиографировали, радиоактивность пятен определяли с помощью жидкостного сцинтилляционного счета. Кдисс определяли из параметров графиков Скэтчарда. Результаты приводятся как средние из 3—5 экспериментов (М ± т).

Измерение аффинности олигонуклеотидов с последовательностью ГРЭ представляется одним из подходов к изучению потенциальной эффективности ГРК как фактора транскрипции, а также для выяснения деталей взаимодействия ГРК— ДНК с прямой и обратной последовательностью в комплексе ГРК—ДНК в тех случаях, когда последовательность не является совершенным палиндромом. С этой целью провели сравнительное исследование констант сродства нативных ГРК с синтетическими олигонуклеотидами, имеющими прямую и обратную последовательность нуклеотидов, а также двуцепочечную форму олиго-ГРЭ, описанного в работе U. Strahle и соавт. [8].

Типичные радиоавтографы гелей с комплексами ГРК — олиго-ГРЭ и одноцепочечными олигонуклеотидами приведены на рис. 1 и 2. На рис. 1 видно, что все 3 типа олигонуклеотидов связыва-

Рис. 2. Электрофорез комплексов ГРК с олигонуклеотидами, имеющими последовательность ГРЭ.

Условия и обозначения те же, что на рис. 1. Конценрация олигонуклеотида в препарате на дорожке: а — 0,03, 0,02, 0,015, 0,012, 0,006 фМ; б — 1,4, 1,0, 0,6, 0,4, 0,2 фМ; в — 6,0, 4,0, 3,0, 2,0, 0,5 фМ на 1,2, 3, 4, 5-й дорожке соответственно.

ются с ГРК специфически, поскольку меченые олиго-ГРЭ вытесняются из комплексов ГРК—ГРЭ 20-кратным избытком "холодных” олиго-ГРЭ. На рис. 2 можно видеть локализацию комплексов на геле, а также то, что имеет место связывание олигонуклеотидов с рецепторами с высоким сродством. Графики Скэтчарда и их статистический анализ представлены на рис. 3.

Согласно данным, полученным в наших экспериментах, наивысшей аффинностью с нативными рецепторами обладают одноцепочечные олигонуклеотиды с прямой последовательностью (K4Mcc 0,2 ± 0,006 пМ) (см. рис. 3, а). Одноцепочечные олигонуклеотиды с антисмысловой последовательностью связываются со значительно меньшим сродством по сравнению с олигонуклеотидами с прямой последовательностью (Кдисс 1,5 ± 0,2 пМ) (см. рис. 3, б), но значительно превосходят по этому показателю двуцепочечную форму олиго-ГРЭ (Кдисс 12,0 ±1,1 пМ) (см. рис. 3, в). Полученные в этом исследовании значения коэффициента диссоциации для олиго- ГРЭ по порядку величины близки к показателям аффинности ГР, экспрессируемого в дрожжах, и олиго-ГРЭ, синтезированного с нуклеотидной последовательностью ГРЭ гена тирозинаминотрансферазы [6]. Анализ комплексов ГРК—ГРЭ методом задержки в геле, проведенный в настоящей работе, показал, что образующиеся ДНК-белко- вые связи являются высокоаффинными. Величины коэффициента диссоциации имеют порядок, характерный для большинства известных специфических рецепторов, что может служить указанием на специфический характер взаимодейст-

Рис. 3. Графики Скэтчарда связывания ГРК с олигонуклеотидами.

а — одноцепочечный с прямой последовательностью; б — одноцепочечный с обратной последовательностью; в — двуцепочечный олиго-ГРЭ.

По осям ординат — В/F; по осям абсцисс — концентрация олигонуклеотида (в фМ). вия, а это в свою очередь указывает на высокую степень нативности ГР в использованном препарате цитозольных ГРК, поскольку известно, что рецепторы с нарушениями своей структуры снижают свое сродство к ДНК [5, 6].

Из результатов, полученных в настоящей работе, следует, что в тех случаях, когда последовательность ГРЭ не образует совершенного палиндрома, аффинность к ГРК в значительной мере определяется структурой олигонуклеотида, и наиболее адекватной, судя по показателям сродства, является смысловая последовательность ГРЭ (см. рис. 3, а). Что касается олигонуклеотидов с обратной последовательностью, то они связывались с ГРЭ со значительно меньшим сродством (см. рис. 3, б), и самым низким сродством с рецепторным комплексом обладал двунитевой олиго-ГРЭ (см. рис. 3, в). Можно полагать, что столь значительные различия в аффинности отражают и столь же существенную разницу в эффективности с точки зрения регуляции транскрипции и, возможно, стабильности образующихся комплексов ГРК—ГРЭ. В настоящее время известно, что сродство ГР к ДНК в значительной мере определяется белок-белковыми взаимодействиями и в первую очередь димеризацией мономеров ГР [2, 5, 7, 9]. С другой стороны, поскольку существенное значение имеют и ядерные белки, не родственные стероидным рецепторам [7—9], использование обогащенного препарата цитозольных комплексов ГР позволяет, на наш взгляд, получить значения показателей аффинности, наиболее приближенные к тем, которые должны быть in situ.

Как было показано ранее, способность ГР к димеризации наиболее выражена у нативных рецепторов с неповрежденной первичной структурой, при этом, однако, имеет значение и структура собственно ГРЭ, особенно расстояние между палиндромными частями этого участка ДНК [6].

Комментируя полученные результаты в целом, можно с определенной осторожностью предположить, что при образовании комплекса ГРК—ГРЭ нити ДНК, находящиеся внутри этого комплекса, испытывают разные по величине силы связывания с рецептором, что должно в конечном счете влиять на конформационное состояние ДНК, по крайней мере в районе ГРЭ. Можно думать, что в таком комплексе появляются условия для разобщения нитей ДНК или повышается вероятность такого события при одновременном действии других ядерных факторов.

Таким образом, полученные результаты дают основания полагать, что в районе ГРЭ, не имеющего структуры совершенного палиндрома, образование комплекса, по-видимому, должно происходить главным образом со смысловой нитью ДНК. Этот результат сам по себе вполне ожидаемый, поскольку исследования взаимодействия фрагмента ГР, содержащего ДНК-связывающий участок, с разными половинами палиндрома ГРЭ, проведенные С. Cairns и соавт. [3], показали, что сродство второй половины палиндрома на порядок ниже по сравнению с первой. Однако при этом возникает вопрос, какое событие при этом является "ключевым”: связывание с ГРК приводит к частичной деспирализации ДНК в районе ГРЭ или, наоборот, для успешного связывания ГРК необходима предварительная деспира- лизация ГРЭ, выполняемая какими-то другими ядерными факторами. Одним из путей получения ответа на этот вопрос может быть исследование образующихся комплексов, состоящих из ГРК, ядерных белков и ДНК, с точки зрения изменения их внутренней энергии. Подход, позволяющий определять константы аффинности отдельных компонентов в таких больших комплексах, может быть полезен для понимания процессов гормональной регуляции транскрипционной активности в целом.