Определяли величину константы сродства комплексов глюкокортикоидного рецептора (ГР), выделенного в виде комплекса с триамцинолоном, и синтетического олигонуклеотидного глюкокортикоидреспонсивного элемента (ГРЭ), соответствующего последовательности ГРЭ-1 из промотора гена тирозинаминотрансферазы крысы. Согласно полученным результатам можно видеть, что наивысшей аффинностью с ГР обладают одноцепочечные олигонуклеотиды с прямой последовательностью (Кдисс 0,2 ± 0,006 пМ). Одноцепочечные олигонуклеотиды с антисмысловой последовательностью связываются со значительно меньшим сродством (Kfiucc 1,5 ± 0,2 пМ), но значительно превосходят по этому показателю двуцепочечную форму олиго-ГРЭ (Кдисс 12,0 ±1,1 пМ). Полученные результаты дают основания полагать, что образование комплекса, по-видимому, должно происходить главным образом со смысловой нитью ДНК, с другой стороны, можно думать, что взаимодействие ГР с ГРЭ должно способствовать конформационным изменениям ДНК в этом районе гена.
The constant of affinity between glucocorticoid receptor (GR) complex isolated together with triamcinolone and a synthetic oligonucleotide glucocorticoid-responsive element (GRE) corresponding to the GRE-1 sequence of the rat thyrosine aminotransferase gene promoter is assessed. Singlestranded oligonucleotides with the straight sequence (Kd 0.2 ± 0.006 pM) possess the highest affinity for GR. The affinity of single-stranded oligonucleotides with antisense sequence is far lower (Kd 1.5 ± 0.2 pM), but is superior to that of double-stranded oligo GRE (Kd 12.0+ 1.1 pM). The results suggest that the complexes are formed mainly with the sense strand of DNA; on the other hand, it is probable that the reaction of glucocorticoid receptor with GRE promotes conformational changes of DNA in this gene region.
Исследование функции глюкокортикоидных гормонов (ГК) — одна из труднорешаемых проблем современной физиологии. Всеобщий характер присутствия этих гормонов в организме усложняет выявление их специфических функций, которые, очевидно, значительно шире участия в стрессовом ответе и известных фармакологических эффектах. В то же время можно думать, что исследования на клеточном и молекулярном уровнях позволят вычленять мишени этих гормонов, в частности глюкокортикоидрегулируемые гены. Реактивность клеток по отношению к ГК определяется наличием в клетке механизма трансдукции сигнала этих гормонов, в котором центральным звеном является рецептор ГК (ГР) — растворимый внутриклеточный белок, который относят к семейству гормонально-регулируемых факторов транскрипции [
Рис. 1. Конкурентное вытеснение меченых олиго-ГРЭ из комплексов ГРЭ—ГРК.
Условия приведены в разделе "Материалы и методы", а — одноцепочечный с прямой последовательностью; б — одноцепочечный с обратной последовательностью; в — двуцепочечный олиго-ГРЭ. Концентрация олигонуклеотида в препарате на дорожке: левая дорожка — меченый олиго-ГРЭ 1,0 фМ; правая дорожка — меченый олиго-ГРЭ 1,0 фМ + "холодный" 20 фМ.
следование констант сродства нативных ГРК с синтетическими олигонуклеотидами, имеющими прямую и обратную последовательность нуклеотидов, а также двуцепочечную форму олиго-ГРЭ, описанного в работе U. Strahle и соавт. [
Самцов крыс линии Вистар массой 180—200 г получали из лаборатории экспериментальных животных Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск). Анестезию проводили тиопенталом (1 мг/100 г).
Приготовление препарата ГРК. Печень крысы гомогенизировали в 5-кратном объеме ТЕ, содержащем 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1 мМ PMSF и 5% глицерин. Гомогенат центрифугировали 10 мин при 5000 g, затем супернатант центрифугировали 1 ч при 105 000 g, инкубировали в присутствии 10 нМ 3Н-триамцинолона 15 мин при 20°С и наносили на колонку mono-Q в буфере того же состава, за исключением глицерина, ГРК элюировали линейным градиентом NaCl 0,0—0,3 М. Элюент из пика специфического связывания объединяли и использовали как препарат частично очищенного ГРК. Все манипуляции, за исключением инкубации, проводили в ледяной бане.
Синтетические олигонуклеотиды с последовательностью TGTACAGGATGTTCT, соответствующей ГРЭ-1 из промотора гена тирозинаминотрансферазы крысы [
Определение констант диссоциации Кдисс. Для образования комплексов ГРК—ГРЭ, различные концентрации олигонуклеотидов инкубировали с равными количествами препарата ГРЭ (10—15 мкг белка) 10 мин при 37°С в среде, содержащей 0,1 мкг ДНК из тимуса теленка, 4% глицерин, 1 мМ DTT, 40 мМ NaCl, 0,1 мМ PMSF, 2,5 мМ MgCl2, 0,1 мМ EDTA, 10 мМ HEPES. Концентрации меченых олигонуклеотидов приводятся в подписях к соответствующим рисункам. Образцы объемом 15 мкл наносили на 12% полиакриламидный гель и проводили электрофорез в неденатурирующих условиях в 0,5 PBS с напряженностью электрического поля 13 В/см в течение 3 ч. Гели авто- радиографировали, радиоактивность пятен определяли с помощью жидкостного сцинтилляционного счета. Кдисс определяли из параметров графиков Скэтчарда. Результаты приводятся как средние из 3—5 экспериментов (М ± т).
Измерение аффинности олигонуклеотидов с последовательностью ГРЭ представляется одним из подходов к изучению потенциальной эффективности ГРК как фактора транскрипции, а также для выяснения деталей взаимодействия ГРК— ДНК с прямой и обратной последовательностью в комплексе ГРК—ДНК в тех случаях, когда последовательность не является совершенным палиндромом. С этой целью провели сравнительное исследование констант сродства нативных ГРК с синтетическими олигонуклеотидами, имеющими прямую и обратную последовательность нуклеотидов, а также двуцепочечную форму олиго-ГРЭ, описанного в работе U. Strahle и соавт. [
Типичные радиоавтографы гелей с комплексами ГРК — олиго-ГРЭ и одноцепочечными олигонуклеотидами приведены на рис. 1 и 2. На рис. 1 видно, что все 3 типа олигонуклеотидов связыва-
Рис. 2. Электрофорез комплексов ГРК с олигонуклеотидами, имеющими последовательность ГРЭ.
Условия и обозначения те же, что на рис. 1. Конценрация олигонуклеотида в препарате на дорожке: а — 0,03, 0,02, 0,015, 0,012, 0,006 фМ; б — 1,4, 1,0, 0,6, 0,4, 0,2 фМ; в — 6,0, 4,0, 3,0, 2,0, 0,5 фМ на 1,2, 3, 4, 5-й дорожке соответственно.
ются с ГРК специфически, поскольку меченые олиго-ГРЭ вытесняются из комплексов ГРК—ГРЭ 20-кратным избытком "холодных” олиго-ГРЭ. На рис. 2 можно видеть локализацию комплексов на геле, а также то, что имеет место связывание олигонуклеотидов с рецепторами с высоким сродством. Графики Скэтчарда и их статистический анализ представлены на рис. 3.
Согласно данным, полученным в наших экспериментах, наивысшей аффинностью с нативными рецепторами обладают одноцепочечные олигонуклеотиды с прямой последовательностью (K4Mcc 0,2 ± 0,006 пМ) (см. рис. 3, а). Одноцепочечные олигонуклеотиды с антисмысловой последовательностью связываются со значительно меньшим сродством по сравнению с олигонуклеотидами с прямой последовательностью (Кдисс 1,5 ± 0,2 пМ) (см. рис. 3, б), но значительно превосходят по этому показателю двуцепочечную форму олиго-ГРЭ (Кдисс 12,0 ±1,1 пМ) (см. рис. 3, в). Полученные в этом исследовании значения коэффициента диссоциации для олиго- ГРЭ по порядку величины близки к показателям аффинности ГР, экспрессируемого в дрожжах, и олиго-ГРЭ, синтезированного с нуклеотидной последовательностью ГРЭ гена тирозинаминотрансферазы [
Рис. 3. Графики Скэтчарда связывания ГРК с олигонуклеотидами.
а — одноцепочечный с прямой последовательностью; б — одноцепочечный с обратной последовательностью; в — двуцепочечный олиго-ГРЭ.
По осям ординат — В/F; по осям абсцисс — концентрация олигонуклеотида (в фМ). вия, а это в свою очередь указывает на высокую степень нативности ГР в использованном препарате цитозольных ГРК, поскольку известно, что рецепторы с нарушениями своей структуры снижают свое сродство к ДНК [5, 6].
Из результатов, полученных в настоящей работе, следует, что в тех случаях, когда последовательность ГРЭ не образует совершенного палиндрома, аффинность к ГРК в значительной мере определяется структурой олигонуклеотида, и наиболее адекватной, судя по показателям сродства, является смысловая последовательность ГРЭ (см. рис. 3, а). Что касается олигонуклеотидов с обратной последовательностью, то они связывались с ГРЭ со значительно меньшим сродством (см. рис. 3, б), и самым низким сродством с рецепторным комплексом обладал двунитевой олиго-ГРЭ (см. рис. 3, в). Можно полагать, что столь значительные различия в аффинности отражают и столь же существенную разницу в эффективности с точки зрения регуляции транскрипции и, возможно, стабильности образующихся комплексов ГРК—ГРЭ. В настоящее время известно, что сродство ГР к ДНК в значительной мере определяется белок-белковыми взаимодействиями и в первую очередь димеризацией мономеров ГР [2, 5, 7, 9]. С другой стороны, поскольку существенное значение имеют и ядерные белки, не родственные стероидным рецепторам [7—9], использование обогащенного препарата цитозольных комплексов ГР позволяет, на наш взгляд, получить значения показателей аффинности, наиболее приближенные к тем, которые должны быть in situ.
Как было показано ранее, способность ГР к димеризации наиболее выражена у нативных рецепторов с неповрежденной первичной структурой, при этом, однако, имеет значение и структура собственно ГРЭ, особенно расстояние между палиндромными частями этого участка ДНК [
Комментируя полученные результаты в целом, можно с определенной осторожностью предположить, что при образовании комплекса ГРК—ГРЭ нити ДНК, находящиеся внутри этого комплекса, испытывают разные по величине силы связывания с рецептором, что должно в конечном счете влиять на конформационное состояние ДНК, по крайней мере в районе ГРЭ. Можно думать, что в таком комплексе появляются условия для разобщения нитей ДНК или повышается вероятность такого события при одновременном действии других ядерных факторов.
Таким образом, полученные результаты дают основания полагать, что в районе ГРЭ, не имеющего структуры совершенного палиндрома, образование комплекса, по-видимому, должно происходить главным образом со смысловой нитью ДНК. Этот результат сам по себе вполне ожидаемый, поскольку исследования взаимодействия фрагмента ГР, содержащего ДНК-связывающий участок, с разными половинами палиндрома ГРЭ, проведенные С. Cairns и соавт. [
The authors declare that there are no conflicts of interest present.