Дефицит P450cl7 (17а-гидроксилаза/17,20-лиа за) является одним из редких наследственных на рушений стероидогенеза. Р450с17 экспрессирован как в надпочечниках, так и в гонадах, где он ката лизирует 2 стероидогенные реакции: 17а-гидро- ксилирование прегненолона и прогестерона соот ветственно до 17-гидроксипрегненолона и 17-гид- роксипрогестерона, а также последующее превра щение этих стероидов в дегидроэпиандростерон и андростендион посредством расщепления С17,20- углеродной связи.

Результатом дефицита 17а-гидроксилазы явля ется нарушение синтеза кортизола, что приводит к гиперпродукции АКТГ, активации синтеза пред шественников альдостерона (кортикостерона и 11-дезоксикортикостерона - 11-ДОК) и развитию низкорениновой гипертензии. В результате де фектного 17а-гидроксилирования и снижения экс прессированной в гонадах 17,20-лиазной активно сти фермента нарушен также синтез половых сте роидов как женскими, так и мужскими гонадами. У плода с генетически мужским полом при этом про исходит недоразвитие наружных гениталий, кото рые, как правило, имеют практически феминное строение (ложный мужской гермафродитизм - ЛМГ). При кариотипе 46,XX формирование внут ренних и наружных половых органов не нарушено, а гипофункция яичников проявляется только в пу бертате.

Дефицит Р450с17 является редкой патологией - всего в литературе описано около 130 случаев за болевания. Первый случай недостаточности 17а- гидроксилазы был описан Beglieri и соавт. в 1966 г. у пациента с кариотипом 46,XX с гипертензией, ги покалиемией, отсутствием развития молочных же лез, оволосения и первичной аменореей [3]. Через 4 года New описала данный синдром у пациента с кариотипом 46,XY с женским строением наружных гениталий, отсутствием оволосения и молочных желез [5].

Недостаточность Р450с17 может быть установ лена при системном исследовании стероидогенеза (мультистероидном анализе), при котором прово дится определение не только конечных продуктов синтеза, но и их предшественников. В последние годы все более значимое место в диагностике вро жденных нарушений стероидогенеза, в частности дефицита Р450с17, занимают также молекулярно генетические исследования. CYP17 - ген, коди рующий Р450с17, расположен на длинном плече хромосомы 10 (10q24-q25) [8]. Ген состоит из 8 эк зонов, охватывающих область около 8 кб (рис. 1), и имеет гомологию с геном CYP21, кодирующим Р450с21 (21-гидроксилазу) [6]. К настоящему вре мени в литературе имеются описания более 25 раз личных мутаций гена CYP17.

В данной работе мы приводим клинические на блюдения, а также результаты гормональных и мо лекулярных исследований у 6 пациентов с дефици том Р450с17. Клинические описания 2 из представ ленных в настоящей работе случаев (пациенты № 1 и 2) были нами частично даны ранее [1].

Материалы и методы

Гормональные исследования. У 5 из 6 пациентов (сыворотка у пациента № 5 была недоступна) де фицит Р450с17 был заподозрен на основании по вышенного базального уровня кортикостерона (см. выше). Для скрининг-диагностики дефицита Р450с17 проводили определение кортикостерона в сыворотке методом, разработанным в лаборатории биохимической эндокринологии и гормонального анализа (зав. - проф. Н. П. Гончаров) ЭНЦ РАМН с использованием высокоспецифичной антисыво ротки. Определение уровней Л Г, ФСГ, тестостеро на, кортизола и альдостерона в сыворотке, а также активности ренина в плазме проводили в той же лаборатории с помощью РИА с использованием коммерческих наборов.

Дополнительно у пациентов № 2, 3, 4 и 6 был проведен мультистероидный анализ с одновремен ным определением в плазме крови содержания аль достерона, кортикостерона, 11-ДОК, прогестеро на, 17-ОН-прогестерона, 11 -дезоксикортизола, кортизола, кортизона, андростендиона и тестосте рона с помощью РИА после экстракции и выделе ния стероидов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием ме тода, разработанного Sippell и соавт. [7]. Стероид ный профиль у этих больных был исследован до и через 60 мин после стимуляции АКТГ (внутривен но, 250 мкг).

Мультистероидный анализ проводили в лабора тории отделения детской эндокринологии (зав. - проф. В. Зиппель) детской клиники Университета Христиана Альбрехтса (Киль, Германия).

Молекулярно-генетические исследования. Геном ная ДНК была выделена из периферических лей-

----------------------  5832 Ьр -----------------------------

4Zh--СИЗ--?HZhS-

1586 Ьр                   867 Ьр                        633 Ьр

коцитов с использованием стандартных методов. Ген CYP17 был амплифицирован с помощью ПЦР. Были использованы 4 пары праймеров для ампли фикации соответственно экзонов 1, 2-3, 4-6 и 7- 8 (см. рис. 1). Последовательность олигонуклеоти дов, использованных для амплификации, была опубликована ранее в работе Picado-Leonard и со авт. [6]. Продукты ПЦР были секвенированы с по мощью автоматического секвенатора ABI PRISM Model 310 ("Perkin Elmer", США). Молекулярно-ге нетические исследования проводили в лаборато рии отделения детской эндокринологии (зав. - проф. В. Зиппель) детской клиники Университета Христиана Альбрехтса (Киль, Германия).

Клиническая характеристика больных представ лена в табл. 1.

Из анамнеза: в возрасте 4 и 11 лет оперирована по поводу паховых грыж (гонады удалены). С 15 лет беспокоят головные боли, повышения АД до 200/120 мм рт. ст. (гипотензивная терапия без эффекта). В 17 лет проведено генетическое обследование: ка риотип 46,XY; поставлен диагноз: синдром тести кулярной феминизации (СТФ). В 25 лет перенесла острое нарушение мозгового кровообращения.

Объективно: телосложение астеническое, рост 172 см, масса тела 62 кг, подкожная жировая клет чатка развита слабо. АД 180/130 мм рт. ст. Половое развие: Таннер II (Р2), состояние после эндопро тезирования молочных желез. Наружные половые органы сформированы по женскому типу, глубина влагалища 7 см.

Клиническая характеристика больных

Таблица 1

Биохимия крови: калий 3,2 ммоль/л (норма

Гормональное обследование: ФСГ 71,5 Ед/л (норма 1,6-6,6 Ед/л), ЛГ 52,3 Ед/л (норма 3- 12 Ед/л), тестостерон 0,35 нг/мл (норма 3,7-

Гормоны в моче: свободный кортизол 14,9 нг/мл (норма 43,5-145 нг/мл), ДГА-С 80,3 нг/мл (норма 147-737 нг/мл). УЗИ надпочечников: надпочечни ки увеличены, объемных образований нет. Рентге нография грудного и поясничного отделов позво ночника: остеопороз. Назначена заместительная гормональная терапия дексаметазоном и женскими половыми гормонами. На фоне лечения дексаме тазоном (1-0,5 мг/сут) АД стабилизировалось на цифрах 140-150/90-100 мм рт. ст., уровень калия повысился до 4,6-4,9 ммоль/л.

Из анамнеза: имеет здорового брата (женат, имеет сына) и сестру с аналогичными жалобами. В возрасте 12 лет заподозрен диагноз СТФ после то го, как аналогичный диагноз был поставлен стар шей сестре (случай № 3). С 12 лет периодические повышения АД, с 25 лет АД стабилизировалось на уровне 170-190/110-120 мм рт. ст. с периодиче ским повышением до 220/140 мм рт. ст. Принимала гипотензивные препараты без эффекта.

Объективно: телосложение евнухоидное, рост 185 см, масса тела 65 кг. АД 170/110 мм рт. ст. По ловое развитие: Таннер II (Р2), состояние после эн допротезирования молочных желез, скудное под мышечное оволосение. Status genitalis: урогени тальный синус, мошонкообразные большие поло вые губы, слепо заканчивающееся влагалище, в па ховых областях - гонады объемом 6-8 мл. Биохи мия крови: калий 3,4 ммоль/л (норма 3,6- 5,3 ммоль/л), натрий 141 ммоль/л (норма 120- 150 ммоль/л). УЗИ надпочечников: надпочечники увеличены в размерах (правый - 3,2 х Ц8 см, ле вый - 3,6 х 2,6 см), оба с закругленными конту рами неоднородной структуры, в правом надпочеч нике образование размером 2,4 х 1,8 х 1,3 см, изоэхогенное.

УЗИ органов малого таза: матка не определяет ся. В паховых каналах (в нижней трети) определя ются гонады: справа 2,3 х 2,0 х Ц0 см, слева 2,1 х Ц9 х 0,9 см, оба неоднородной структуры, пониженной эхогенности.

Гормональное обследование: ФСГ 57,1 Ед/л (норма 1,6-6,6 Ед/л), Л Г 52,3 Ед/л (норма 3- 12 Ед/мл), тестостерон 0,46 нг/мл (норма 3,7-

Лечение: дексаметазон 4-0,5 мг/сут, 1/2 таблет ки марвелона. Произведена гонадэктомия. АД ста билизировалось на цифрах 120/70 мм рт. ст., уро вень калия в сыворотке 4,8 ммоль/л. При кон трольном УЗИ надпочечников: выраженная поло жительная динамика, объемных образований не выявлено.

Гистологическое исследование: в обеих гонадах небольшие участки образованы скоплениями узких ’’беспросветных" семенных канальцев, выстланных только незрелыми клетками Сертоли, наблюдается резко выраженная гиперплазия клеток Лейдига, последние лишены липидов (цитоплазматиче ских). Среди скопления клеток Лейдига встречают ся облитерированные семенные канальцы с выра женным гиалинозом базальной мембраны. С обеих сторон имеются недоразвитые придатки семенника и гипоплазированные семявыносящие протоки.

Сибс пациента № 2. В возрасте 5 лет в ходе опе рации по поводу паховой грыжи в грыжевом мешке обнаружен тестикул, который был удален. При ге нетическом обследовании выявлен мужской ка риотип и поставлен диагноз СТФ. С 14 лет отме чается повышение АД.

Объективно: телосложение феминное, рост 175 см, масса тела 75 кг. АД 200/110 мм рт. ст. По ловое развитие: Таннер II: Р2, ВЗ (нерегулярно проводилось лечение эстрогенами), скудное под мышечное и лобковое оволосение. Status genitalis: урогенитальный синус, мошонкообразные боль шие половые губы, слепо заканчивающееся влага лище, в паховых областях: справа - гонада объе мом 6-8 мл. Биохимия крови: калий 5,0 ммоль/л (норма 3,6-5,3 ммоль/л), натрий 140 ммоль/л (нор ма 120-150 ммоль/л). УЗИ надпочечников: правый увеличен (3,4 х ЦЗ см), в левом определяется обра зование размером 2,5 х Ц9 см пониженной эхоген ности (вторичная аденома?). УЗИ щитовидной же лезы: правая доля размером 5,7 х ЗД х 2,6 см, левая доля 4,6 х Ц7 х Ц4 см, толщина перешейка 0,3 см. Объем 27,7 мл. Структура диффузно неоднородная, небольшое снижение эхогенности: в правой доле в верхнем полюсе определяется образование разме ром 3,4 х 2,7 х 2,1 см средней эхогенности.

Пункция узла щитовидной железы: высокодиф ференцированный папиллярный рак. Рекомендо вана тиреоидэктомия.

Гормональное обследование: ФСГ 46,6 Ед/л (норма 1,6-6,6 Ед/л), ЛГ 40,4 Ед/л (норма 3,0- 12,0 Ед/л), тестостерон 0,17 нг/мл (норма 3,7-

Лечение: дексаметазон 1-0,5 мг/сут. На фоне лечения АД 140/100-125/85 мм рт. ст., уровень ка лия в сыворотке 5,0-5,2 ммоль/л. Отмечено нарас тание уровня мочевины в сыворотке (10,6 ммоль/л при норме 3,2-8,0 ммоль/л) и креатинина (126 мкмоль/л при норме 53-110 мкмоль/л).

аменорею, скудное лобковое и подмышечное ово лосение, приливы.

Из анамнеза: имеет здорового брата (не женат) и сестру (кариотип 46,XX), страдающую первичной аменореей и артериальной гипертензией. С детства фиксируются периодические повышения АД. В возрасте 27 лет обследована по поводу первичной аменореи и недостаточного развития вторичных половых признаков (стадия II по Таннеру). На ос новании определения мужского кариотипа, обна ружения гонад с двух сторон в половых губах и от сутствия женских внутренних гениталий диагно стирован СТФ. Произведена двусторонняя гона- дэктомия. Эпизодически получала заместительную терапию эстрогенами. Несмотря на прием гипотен зивных препаратов, сохранялась стойкая артери альная гипертензия (до 200/140 мм рт. ст.). В воз расте 36 лет заподозрена "феохромоцитома" и про изведена односторонняя адреналэктомия.

Объективно: телосложение феминное, рост 170 см, масса тела 80 кг. АД 180/120 мм рт. ст. Щи товидная железа I степени, неравномерной плот ности. Половое развитие: Таннер II (Р2, ВЗ), скуд ное подмышечное оволосение. Status genitalis: сле по заканчивающееся влагалище глубиной 4 см.

Биохимия крови: калий 3,7 ммоль/л (норма

Гормональное обследование: ФСГ 42,4 Ед/л (норма 1,6-6,6 Ед/л), ЛГ 16,2 Ед/л (норма 3-12 Ед/л), тестостерон 0,37 нг/мл (норма 3,7-9,5 нг/мл), кортикостерон 473 нг/мл (норма 8,7-19 нг/мл), альдостерон 0,32 нг/мл (норма 0,03-0,30 нг/мл), кортизол 93,5 нг/мл (норма 54-236 нг/мл).

УЗИ надпочечников: левый удален, правый уве личен в размерах, гипоэхогенное образование диа метром 1,8 см.

УЗИ щитовидной железы: объем 12,2 мл, узло вые образования в нижнем полюсе левой доли диа метром 1,2 см.

Пункция узла щитовидной железы: высокодиф ференцированное образование преимущественно папиллярного строения. Рекомендована тиреои дэктомия. На фоне терапии (дексаметазон 2-0,75 мг/сут, дивина по 1 таблетке в сутки по схеме) АД стабилизировалось на цифрах 130/95 мм рт. ст., уровень калия в сыворотке 5-5,3 ммоль/л, отмече но увеличение концентрации креатинина до ИЗ мкг/л. При контрольном УЗИ надпочечников от мечена положительная динамика.

Из анамнеза: имеет здорового брата (20 лет, не женат). В возрасте 9 лет при операции по поводу паховой грыжи обнаружены гонады, которые были удалены. Поставлен диагноз СТФ, произведена пластика влагалища. С 7 лет эпизодически отмеча ется повышение АД: как правило, не выше 140/95 мм рт. ст., редко - кризы с повышением АД до 180/120 мм рт. ст. Нерегулярно получает гипотен зивные препараты и терапию эстрогенами.

Объективно: телосложение феминное, рост 170 см, масса тела 58 кг. АД 135/95 мм рт. ст. По ловое развитие: Таннер III (Pl, ВЗ), подмышечное оволосение отсутствует. Status genitalis: состояние после гонадэктомии и кольпопоэза.

Гормональное обследование: ФСГ 24,5 Ед/л (норма 1,6-6,6 Ед/л), Л Г 34,5 Ед/л (норма 3- 12 Ед/л), тестостерон 0,52 нг/мл (норма 3,7-

Биохимия крови: калий 4,3 ммоль/л (норма

УЗИ надпочечников: умеренная диффузная ги перплазия надпочечников.

Лечение: дексаметазон 0,25 мг/сут, антеовин по 1 таблетке в сутки по схеме. АД стабилизировалось на цифрах 120/80 мм рт. ст., уровень калия в сыво ротке 4,3-4,5 ммоль/л. При контрольном УЗИ надпочечников отмечена выраженная положитель ная динамика, объемных образований не выяв лено.

Результаты и их обсуждение

Исследование стероидогенеза. У 5 из 6 пациентов (сыворотка у пациента № 5 была недоступна) де фицит Р450с17 был заподозрен на основании по вышенного базального уровня кортикостерона (см. выше). У пациентов № 2, 3, 4 и 6 стероидный про филь был исследован до и через 60 мин после сти муляции АКТГ (внутривенно, 250 мкг) (табл. 2). У всех обследованных больных отмечалось снижение базальных и (или) стимулированных уровней 17- ОН-прогестерона, 11-дезоксикортизола, кортизо ла, кортизона, андростендиона и тестостерона, в то

Результаты мультистероидного анализа плазмы до и после внутривенного введения АКТГ у пациентов № 2, 3, 4 и 6

Примечание, а - до введения АКТГ, б - после введения АКТГ.

время как концентрации прогестерона, кортико стерона и 11-ДОК были значительно повышены, что свидетельствовало о сочетанной недостаточно сти 17а-гидрокс плазы и 17,20-лиазы. Интересно, что у пациента с незначительно выраженной арте риальной гипертензией (№ 6) степень повышения 11-ДОК была минимальной. Несмотря на повыше ние концентраций его предшественников, уровни самого альдостерона после стимуляции АКТГ были в пределах нормы. Последнее отражает особенно сти регуляции клубочковой зоны коры надпочеч ников, функция которой определяется прежде все го активностью ренин-ангиотензиновой системы, а не стимулирующим эффектом АКТГ. При дефи ците 17а-гидроксилазы избыточная продукция сте роидов с минералокортикоидной активностью (11- ДОК) приводит к подавлению активности ренин- ангиотензиновой системы, что и объясняет нор мальный уровень альдостерона.

Молекулярно-генетические исследования. Иссле дование гена СУР 17 было проведено у всех боль ных (табл. 3). У 1 пациента была выявлена гомози готная мутация в экзоне 1. В данном случае была обнаружена транзиция G -> А в положении 287, что привело к замене аргинина (CGG) на глутамин (CAG) в кодоне 96 (рис. 2). У сибсов в семьях II и III (пациенты № 2-5) была выявлена одинаковая мутация в экзоне 6 (нуклеотид 1078), приведшая к замене валина (GTG) на лейцин (TTG) в кодоне 360 (рис. 3). В обеих семьях родители были гетеро зиготными носителями данной мутации. Гетерози готная мутация V360L была также выявлена у здо рового сибса в семье II. Наконец, у пациента № 6 была обнаружена составная гетерозиготность по

двум мутациям: в экзоне 6 (замена аргинина на цистеин в кодоне 347) и в экзоне 8 (замена арги нина на цистеин в кодоне 416). Ни одна из обна руженных мутаций не была опубликована ранее.

Представленные случаи иллюстрируют трудно сти диагностики дефицита Р450с17. Как указано выше, все 5 обследованных нами пациентов с муж ским кариотипом первоначально наблюдались с диагнозом СТФ. Действительно, проявления ЛМГ при дефиците Р450с17, особенно в допубертатном периоде, практически идентичны таковым при СТФ: для обоих заболеваний характерны мужской кариотип, отсутствие или низкая степень маскули низации наружных гениталий, отсутствие дерива тов мюллеровых протоков, слепо заканчивающееся влагалище. В отличие от СТФ, однако, у больных с сохраненными гонадами при дефиците Р450с17 (как у мужчин, так и у женщин) не наблюдается спонтанного увеличения грудных желез на фоне

Таблица 3

Характеристика дефектов гена CYP17, выявленных у пациентов с дефицитом Р450с17

Семья

Паци ент

Изменение нуклеотидов

Эк

зон

Измене ние ами нокислоты

Гетерозигот ность у членов се мьи

Рис. 3. Родословная семьи II и фрагменты нуклеотидной по следовательности гена CYP17 одного из пробандов (пациент № 2) и отца. У обоих сибсов была выявлена мутация в экзоне 6 (нуклеотид 1078), приведшая к замене валина (GTG) на лей цин (TTG) в кодоне 360. Родители и здоровый сибс были гете розиготными носителями данной мутации.

1246: CGT -> TGT

/ - 46, XY, фенотип женский, гомозиготен по мутации; 2 - 46, XY, фенотип муж ской, гетерозиготен по мутации; 3 - 46, XX, фенотип женский; 4 - 46, XX, фено тип женский, гетерозиготен по мутации.

пубертата, или оно выражено незначительно. На конец, сочетание синдрома ЛМГ или первичной аменореи с артериальной гипертензией с большой вероятнотью позволяет подозревать дефицит Р450с17.

Повышение АД отмечалось у всех обследован ных нами пациентов. Выраженность артериальной гипертензии, однако, может быть различной, что, по-видимому, обусловлено разной степенью дефи цита 17а-гидроксилазы. Так, у 5 наблюдаемых на ми пациентов артериальная гипертензия имела злокачественный характер, тогда как в одном слу чае (пациент № 6) наблюдалось умеренное повы шение АД, что не сопровождалось гипокалиемией. Как правило, артериальная гипертензия выявляет ся у больных с дефицитом Р450с17 в пубертатном периоде, а иногда и позже. Описаны также формы, протекающие без повышения АД [9]. Предполага ется, что в таких случаях дефект гена CYP17 при водит к преимущественному нарушению 17,20-ли- азной активности фермента и сохранению его 17а-гидроксил азной активности. Интересно, что у пациента с селективным снижением активности 17,20-лиазы, обследованного Geller и соавт. [4], была обнаружена гомозиготная мутация гена CYP17 в том же кодоне (R347H), что и одна из ге терозиготных мутаций (R347C), выявленных у на блюдаемого нами пациента с незначительным по вышением АД и нормокалиемией (пациент № 6). Как было показано в эксперименте с экспрессией мутантного фермента in vitro, дефект R347H сопро вождается сохранением 66% активности 17а-гид- роксилазы, но полной потерей активности 17,20- лиазы [4]. Кодон, в котором была обнаружена вто рая гетерозиготная мутация у пациента № 6 (R416C), находится по соседству с кодоном 417, мутация в котором (F417C) также была ассоцииро вана с селективным снижением 17,20-лиазной ак тивности и сохранением на 25% Па-гидроксилаз ной активности [2]. Компьютерное моделирование трехмерной структуры Р450с17 свидетельствует о том, что оба аминокислотных остатка (347 и 417) находятся в области связывания энзима с белком- донором электронов. Предполагается, что мутации в этой области приводят к селективному наруше нию переноса электронов, необходимых для 17,20- лиазной реакции [4, 2].

Как следует из представленных наблюдений, за местительная терапия глюкокортикоидами позво ляет достаточно быстро добиться снижения АД у больных с дефицитом Р450с17. Между тем необхо димо учитывать, что у тех пациентов, у которых ар териальная гипертензия существует многие годы, лечение должно проводиться с осторожностью. На фоне лечения дексаметазоном нами было отмечено повышение уровней мочевины и креатинина в сы воротке у 2 наиболее старших по возрасту больных (пациенты № 3 и 4). Можно предположить, что длительно существующая артериальная гипертен зия приводит к нарушению функции почек, кото рое прогрессирует при снижении перфузии. Имен но изменением почечной функции можно объяс нить отсутствие гипокалиемии у одного из этих больных (пациент № 3).

Совершенно неожиданным для нас было выяв ление папиллярного рака щитовидной железы у 2 наших больных (пациенты № 3 и 4). Пока неясно, могут ли дефицит Р450с17 и длительно существую щий некомпенсированный гипергонадотропный гипогонадизм способствовать развитию папилляр ного рака или сочетание этих двух заболеваний случайно. Интересно, что оба эти пациента имели одинаковую мутацию гена GYP 17 (V360L). В лите ратуре нам не удалось найти описаний случаев рака щитовидной железы у больных с дефицитом P450M7.

Заключение

Таким образом, использование современных методов гормонального анализа и молекулярных исследований позволяет идентифицировать боль ных с дефицитом Р450с17 - редким вариантом на рушения стероидогенеза. Дефицит Р450с17 должен быть включен в план дифференциальной диагно стики синдрома ЛМГ и первичной гипертензии и гипокалиемии. Выявление мутаций в гене CYP17 дает возможность не только верифицировать диагноз, но и в ряде случаев прогнозировать течение заболевания.