Диагностика новообразований щитовидной железы (ЩЖ) остается актуальной проблемой, особенно когда речь идет о подгруппе фолликулярных опухолей [1]. Выбор тактики лечения пациентов с учетом индивидуальных молекулярно-генетических характеристик опухоли лежит в основе персонифицированной медицины. Возможности использования молекулярно-генетического тестирования широко исследуются в настоящее время. Наиболее часто для данных тестов используют ДНК, выделенную из гистологических срезов или цитологического материала.

Анализ внеклеточной ДНК (жидкостная биопсия) – перспективное направление в современной медицине, особенно в онкологии. Такое исследование позволяет преодолеть ограничения, связанные с получением образцов опухолевой ткани и работой с ними, являясь идеальным инструментом для анализа молекулярно-генетических нарушений у пациентов [2]. Взятие пробы крови является минимально инвазивной процедурой, которая может быть осуществлена в любое время, как до начала лечения, так и в течение курса терапии, что позволяет наблюдать за молекулярными изменениями в опухоли в динамике [3, 4].

При развитии онкологических заболеваний содержание сцДНК в крови достоверно повышается, но при этом не зависит от локализации опухоли [5]. Имеются данные о связи содержания свободно циркулирующей ДНК (сцДНК) в крови с клиническим течением онкологического заболевания [6]. Более высокое по сравнению с нормой содержание сцДНК в крови часто наблюдается уже на ранних стадиях опухолевого процесса, а также может резко возрастать при метастазировании [7]. Концентрация сцДНК может сильно отличаться у разных пациентов [8]. Содержание циркулирующей опухолевой ДНК (цоДНК) в плазме крови крайне низкое: ее количество зависит от стадии заболевания и часто составляет менее 1% от общего количества сцДНК [8, 9]. В связи с этим для обнаружения молекулярно-генетических нарушений в цоДНК необходимы высокочувствительные методы анализа, такие как секвенирование нового поколения (next generation sequencing, NGS) и цифровая полимеразная цепная реакция (ПЦР; droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR). Высокая чувствительность этих методов при анализе соматических мутаций в сцДНК плазмы крови была подтверждена неоднократно [10–12]. Однако их рутинное применение в онкологии ограничено из-за крайне высокой стоимости одного исследования. Одним из перспективных методов анализа сцДНК плазмы крови является метод усиленной аллель-специфической ПЦР, разработанный компанией «Евроген» (Россия) специально для работы с биологическими образцами, содержащими небольшое количество мутантной ДНК. Принцип метода заключается в сочетании аллель-специфической ПЦР с блокадой амплификации аллеля «дикого типа» – так же, как при использовании метода мутационно-специфической ПЦР [13, 14].

Обнаружение мутаций в горячих точках генов BRAF, KRAS, NRAS, EIF1AX, TERT ассоциировано с раком ЩЖ (РЩЖ) и с более агрессивным течением заболевания. В нашем исследовании мы решили оценить возможность использования панели соматических мутаций в клинической практике.

Оценить встречаемость соматических мутаций в «горячих точках» генов BRAF, KRAS, NRAS, EIF1AX и TERT в сцДНК плазмы крови, взятой до оперативного вмешательства, у пациентов с узловыми образованиями ЩЖ, у которых в гистологическом материале обнаружена соответствующая мутация.

Дизайн исследования

Проведено проспективное наблюдательное когортное выборочное одноцентровое открытое контролируемое нерандомизированное клиническое исследование, схема представлена на рис. 1.

Рис. 1. Схема исследования.

Критерии соответствия

Критериями исключения для всех групп были: некомпенсированный тиреотоксикоз, проведенная ранее операция на ЩЖ, отягощенный анамнез по наследственным и семейным формам заболеваний ЩЖ, повышенная концентрация кальцитонина.

Условия проведения

В исследование включали пациентов, находившихся на лечении в хирургическом отделении ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России.

Продолжительность исследования

Набор пациентов в группы продолжался в течение трех лет – с 2012 по 2014 г.

Описание медицинского вмешательства

Все пациенты до включения в исследование получали «Информацию для пациента и информированное согласие для участия в клиническом исследовании». Участие было добровольным. Всем пациентам проводили лабораторно-инструментальный комплекс для подготовки, проведения и послеоперационного наблюдения. Всем пациентам проводили молекулярно-генетическое исследование гистологического материала, парафиновых блоков с операционным материалом и плазмы крови до и после операции. Гистологический материал был предоставлен в виде парафиновых блоков с операционным материалом. Для выделения сцДНК проводили забор периферической крови за день до и на 3–5-е сутки после оперативного вмешательства. Кровь забирали в вакуумные пробирки с консервантом на основе EDTA.

Основной исход исследования

Конечной точкой исследования был показатель встречаемости соматических мутаций в «горячих точках» генов BRAF, KRAS, NRAS, EIF1AX и TERT в сцДНК плазмы крови.

Дополнительный исход исследования

Дополнительной конечной точкой была встречаемость соматических мутаций в «горячих точках» генов BRAF, KRAS, NRAS, EIF1AX и TERT в гистологическом материале.

Методы регистрации исходов

Выделение ДНК из срезов с парафиновых блоков осуществляли с помощью набора реагентов «Экстракт ДНК FFPE» (ЗАО «Евроген», Москва, РФ) в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию и качество выделенной ДНК оценивали с использованием набора реагентов «aXY-Детект» (ООО НПФ «Синтол», Москва, РФ) в соответствии с инструкцией производителя. ДНК, выделенная из образцов, по концентрации и качеству соответствовала критериям для достоверного ПЦР-анализа мутаций.

Секвенирование по Сэнгеру проводили в специализированной лаборатории ЗАО «Евроген Ру» на аппарате «ABI 3500» (Applied Biosystems – часть Thermo Fisher Scientific, США) с использованием рекомендованных производителем наборов реагентов и стандартных операционных процедур.

Поиск мутаций в «горячих точках» генов BRAF (экзон 15) и NRAS (экзон 3, район кодона 61) в ДНК образцов проводили методом мутационно-специфической ПЦР в режиме реального времени с верификацией положительных и сомнительных результатов методом секвенирования продуктов ПЦР по Сэнгеру. Использовали наборы реагентов «Инсайдер BRAF» и «Инсайдер NRAS» (ЗАО «Евроген») в соответствии с инструкцией производителя.

Поиск мутаций в «горячих точках» гена TERT (транскрипт NM_198253.2, промоторная область) в ДНК образцов проводили методом ПЦР с последующим секвенированием продуктов ПЦР по Сэнгеру. Использовали набор реагентов «ГенСкан TERT» (ООО «Евроген Лаб») в соответствии с инструкцией производителя.

Поиск мутаций в других «горячих точках» гена NRAS (экзон 2, район кодонов 12 и 13; экзон 3, район кодона 59; экзон 4, район кодонов 117 и 146) и в «горячих точках» гена KRAS (экзон 2, район кодонов 12 и 13; экзон 3, район кодонов 59 и 61; экзон 4, район кодонов 117 и 146) в ДНК части образцов проводили методом мутационно-специфической ПЦР в режиме реального времени с верификацией положительных и сомнительных результатов методом секвенирования продуктов ПЦР по Сэнгеру. Использовали набор реагентов «Инсайдер PAN-RAS» (ЗАО «Евроген») в соответствии с инструкцией производителя.

Поиск мутаций в «горячих точках» гена EIF1AX (экзон 6) в ДНК части образцов проводили методом ПЦР с последующим секвенированием продуктов ПЦР по Сэнгеру. Использовали набор реагентов «ГенСкан EIF1AX-6» (ООО «Евроген Лаб») в соответствии с инструкцией производителя. Исследовали только образцы, в которых обнаруживались мутации в генах NRAS или KRAS.

Образцы крови обрабатывали в два этапа. Вначале в срок не позднее чем через 4 ч после забора крови отделяли фракцию плазмы крови методом трехэтапного центрифугирования по стандартному протоколу. Затем из плазмы крови выделяли сцДНК с использованием набора реагентов «QiaAmp Circulating Nucleic Acids Kit» (Qiagen, Hilden, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию и качество выделенной ДНК оценивали с использованием набора реагентов «aXY-Детект» (ООО НПФ «Синтол», Москва, РФ) в соответствии с инструкцией производителя.

Поиск мутаций в «горячих точках» экзона 15 гена BRAF и экзона 3 гена NRAS в образцах сцДНК плазмы крови проводили методом высокочувствительной мутационно-специфической ПЦР-РВ в модификации усиленной аллель-специфической ПЦР-РВ с одновременным подавлением амплификации аллелей «дикого типа». Использовали наборы реагентов серии «СуперИнсайдер» (ООО «Евроген Лаб», Россия) в соответствии с инструкцией производителя.

Этическая экспертиза

Протокол исследования был одобрен Межвузовским Комитетом по Этике. Выписка из протокола №02-12 от 16.02.12.

Статистический анализ

Размер выборки был рассчитан для уровня статистической значимости не менее 95% с ДИ±5%. Расчетный минимальный размер выборки составил 83 пациента. Учитывая небольшие объемы выборок и распределения, отличающиеся от нормального, были использованы непараметрические методы анализа данных. Статистическая обработка результатов исследования выполнена с использованием пакета прикладных программ Statistica v 10.0 for Windows (Dell, США). Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05. Встречаемость выражена в абсолютных и относительных числах (доли, проценты). Значимость молекулярных тестов оценивалась на основе отрицательной и положительной прогностической ценности каждого теста.

Объекты (участники) исследования

В исследование включено 153 пациента. Распределение пациентов по группам на основании гистологического заключения представлено на рис. 2.

Рис. 2. Распределение пациентов по группам на основании гистологического заключения (n=153, %).

Основные результаты исследования

Молекулярное тестирование гистологического материала

BRAF, NRAS. Поиск мутаций в «горячих точках» гена BRAF (экзон 15, район кодонов 600–601) выполнен на образцах ДНК, выделенной из гистологического материала 153 пациентов. Мутации обнаружены в 54 случаях. Поиск мутаций в «горячих точках» гена NRAS (экзон 3, район кодона 61) выполнен на образцах ДНК, выделенной из гистологического материала 153 пациентов. Мутации обнаружены в 12 случаях.

KRAS, EIF1AX, TERT. Мутации в других «горячих точках» гена NRAS (экзон 2, район кодонов 12 и 13; экзон 3, район кодона 59; экзон 4, район кодонов 117 и 146), а также в «горячих точках» гена KRAS (экзон 2, район кодонов 12 и 13; экзон 3, район кодонов 59 и 61; экзон 4, район кодонов 117 и 146), EIF1AX (экзоны1, 2 и 6) и TERT (транскрипт NM_198253.2, промоторная область, район позиций c.1-146 – c.1-124) не обнаружены ни в одном образце.

Молекулярное тестирование плазмы крови

BRAF, NRAS. Поиск мутаций в «горячих точках» гена BRAF (экзон 15, район кодонов 600–601) и NRAS (экзон 3, район кодона 61) на образцах ДНК, выделенной из плазмы крови до операции, выполнен у 66 пациентов. Поиск мутаций производился только в образцах крови пациентов, у которых по данным молекулярно-генетического тестирования гистологического материала были выявлены таргетные мутации генов BRAF и NRAS.

Мутация BRAF c.1799T>A, p.(Val600Glu, V600E) [COSMIC ID 476] обнаружена в 1 случае. Данные представлены в табл. 1. По результатам гистологического исследования операционного материала у этого пациента с мутацией в гене BRAF был выявлен ПРЩЖ.

Таблица 1. Частота встречаемости мутаций в «горячих точках» гена BRAF (экзона 15, район кодонов 600–601) в плазме крови

Мутация NRAS c.181C>A, p.(Gln61Lys, Q61K) [COSMIC ID 580] обнаружена в 1 случае. Данные представлены в табл. 2. По результатам гистологического исследования операционного материала был выявлен УКЗ.

Таблица 2. Частота встречаемости мутаций в «горячих точках» гена NRAS (экзон 3, район кодона 61) в плазме крови

Таким образом, позитивная прогностическая ценность мутационного теста по гену BRAF, выполняемого в плазме крови, в отношении злокачественного характера опухоли ЩЖ составила PPV=(1/54)=1,8%. Прогностическая ценность мутационного теста по гену NRAS, выполняемого в плазме крови, в отношении злокачественного характера опухоли ЩЖ составила PPV=0%. Прогностическая ценность отрицательного результата данного теста по гену NRAS в отношении доброкачественного характера опухоли ЩЖ составила NPV=(1/12)=8,3%.

Нежелательные явления

У части пациентов после оперативного вмешательства отмечались клинические и лабораторные признаки транзиторной гипокальциемии, которые быстро купировались приемом препаратов кальция и витамина Д.

Резюме результатов исследования

По результатам молекулярно-генетического исследования плазмы крови можно сделать следующие выводы:

– частота обнаружения мутации BRAF в общей когорте составила 1,8%;

– частота обнаружения мутации NRAS в общей когорте составила 8,3%;

– встречаемость мутаций в сцДНК плазмы крови при новообразованиях ЩЖ крайне мала и имеет низкую предсказательную силу как в отношении доброкачественного, так и злокачественного характера опухоли.

По результатам молекулярно-генетического исследования гистологического материала можно сделать следующие выводы:

– частота обнаружения мутации BRAF в общей когорте составила 35,3%;

– частота обнаружения мутации NRAS в общей когорте составила 7,8%;

– не были обнаружены мутации в других «горячих точках» гена NRAS и генов KRAS, TERT, EIF1AX;

Исследованные нами мутации в горячих точках генов BRAF, KRAS, NRAS, EIF1AX, TERT, согласно данным литературы, ассоциированы с РЩЖ и с более агрессивным течением заболевания [15].

Ген BRAF кодирует цитоплазматический белок, участвующий во внутриклеточной передаче сигнала от рецепторов факторов роста. Мутации гена BRAF чаще всего локализуются в 15-м экзоне гена BRAF (кодоны 600-601), реже встречаются «неклассические» мутации в 11-м и 15-м экзонах гена BRAF (в районе кодонов 469, 570-598, 603-605) [16, 17]. Данные исследований прогностической значимости мутаций гена BRAF свидетельствуют о том, что в целом BRAF V600E-позитивные опухоли имеют более высокий риск агрессивного течения заболевания, рецидива и смертности [18, 19]. В нашем исследовании частота выявления мутаций сходна с данными литературы, и наиболее частым вариантом мутации была c.1799T>A, p.(Val600Glu, V600E) [COSMIC ID 476], которая и выявлена в 1 случае в сцДНК плазмы крови.

Согласно данным обзора G. Howell 2013 г. [20], мутации RAS являются вторыми по распространенности после BRAF, однако их роль до конца не понятна, поскольку они встречаются при всех патоморфологических типах новообразований ЩЖ – от доброкачественных до анапластического рака. Гены NRAS и KRAS кодируют цитоплазматические белки, участвующие во внутриклеточной передаче сигнала от рецепторов факторов роста.

Ген NRAS относится к протоонкогенам; примерно в 15% случаев злокачественных опухолей человека обнаруживаются активирующие соматические мутации в этом гене, которые чаще всего локализуются в экзоне 3 (кодоны 59 и 61) и реже в экзоне 2 (кодоны 12 и 13) или в экзоне 4 (кодоны 117 и 146). В нашем исследовании частота выявления мутаций сходна с данными литертуры, и наиболее частым вариантом мутации была c.182A>G, p. (Gln61Arg, Q61R) [COSMIC ID 584], которая выявлена в 1 случае в сцДНК плазмы крови.

Ген KRAS относится к протоонкогенам; примерно в 30–40% случаев злокачественных опухолей человека обнаруживаются активирующие соматические мутации в этом гене, которые чаще всего локализуются в экзоне 2 (кодоны 12 и 13) и реже в экзоне 3 (кодоны 59 и 61) или в экзоне 4 (кодоны 117 и 146) [16, 17, 20].

Ген TERT кодирует каталитическую субъединицу теломеразной обратной транскриптазы – ядерный белок, выполняющий ключевую роль в реакции поддержания длины теломер.

Мутации в гене TERT ассоциированы с более агрессивным течением РЩЖ, а в сочетании с мутацией BRAF V600E или другими генетическими маркерами (например, мутациями RAS) оказываются еще более клинически значимыми при РЩЖ [21–23]. Сосуществующие мутации промотора TERT и мутация V600E гена BRAF оказывают сильное синергетическое влияние на агрессивность ПРЩЖ, включая увеличение риска рецидива и смертности пациентов, в то время как любая мутация сама по себе оказывает «скромное» влияние [24–27].

Ген EIF1AX кодирует цитоплазматический белок, участвующий в трансляции (синтезе белка на матрице мРНК). Мутации гена EIF1AX были обнаружены ранее только при ПРЩЖ и анапластическом РЩЖ. Распространенность этих мутаций при других видах рака щитовидной железы и в доброкачественных новообразованиях была неизвестна. Однако в исследовании A. Karunamurthy 2016 г. [28] было показано, что мутации EIF1AX обнаруживаются не только при раке щитовидной железы, но и при доброкачественных новообразованиях. Кроме того, в нескольких случаях РЩЖ было обнаружено сочетание мутаций в генах EIF1AX и RAS. Так, при фолликулярных опухолях щитовидной железы одновременное обнаружение мутаций в генах EIF1AX и RAS однозначно говорит о злокачественном характере опухоли. При анапластическом раке щитовидной железы наличие мутации в гене EIF1AX является предиктором особенно агрессивного течения заболевания [28].

В нашем исследовании отсутствие мутаций в «горячих точках» генов NRAS, KRAS, TERT и EIF1AX, возможно, связано с выбором пациентов, включенных в исследование, поскольку исходно набирали пациентов с ВДРЩЖ низкого риска [29, 30], а также пациентов с НОЩЖ или УКЗ, для которых не характерно агрессивное течение заболевания, с которым связывают выявление данных маркеров.

В нашем исследовании частота выявленных мутаций в гене BRAF и в гене NRAS в сцДНК плазмы крови составило всего по 1 случаю каждой мутации. Может существовать несколько причин такой низкой частоты выявленных мутаций. Согласно данным литературы, наиболее часто выявление опухолевой сцДНК плазмы крови ассоциировано с более агрессивными формами рака: колоректальный рак, немелкоклеточный рак легкого, рак молочной железы, рак яичников. Данные по исследованию сцДНК при РЩЖ в литературе практически не встречаются. Кроме того, выявлены ассоциации между более агрессивным течением заболевания с рецидивирующим течением, метастазированием и выявлением мутаций в сцДНК опухолевой ткани. Поэтому, возможно, низкая частота выявления мутаций в нашем исследовании связана с тем, что в исследование были включены пациенты с ВДРЩЖ низкого риска, НОЩЖ и УКЗ, что предполагает благоприятный прогноз у данных пациентов.

Во-вторых, возможно, метод, использованный для выявления мутаций и применением сочетания аллель-специфической ПЦР с блокадой амплификации аллеля «дикого типа» имеет недостаточную чувствительность.

Для решения данного вопроса необходимы дополнительные исследования, поскольку неинвазивный мониторинг течения заболевания с использованием молекулярно-генетических исследований – одно из перспективных направлений при персонализированном подходе к лечению пациента, который возможно применять не только для диагностики заболевания, но и для наблюдения за пациентом в динамике.

Ограничения исследования

Поскольку в исследование были включены только пациенты с ВДРЩЖ низкого риска, то, возможно, включение пациентов с ВДРЩЖ высокого риска могло бы значимо повлиять на результаты.

Использование свободно циркулирующей ДНК плазмы крови при тестировании исследованной выборки не показало целесообразности для диагностики малых опухолей щитовидной железы.

Полученные в ходе исследования результаты позволят улучшить подходы к персонифицированному ведению пациентов и дают направления для дальнейших проспективных исследований.