В 1935 г. L. Musajo и соавт. сообщили о синтезе ксантуреновой кислоты. Это химическое вещество было выделено из мочи экспериментальных животных и идентифицировано как 4,8- дигидрооксихинолин-2-карбоновая кислота [55]. Химическая формула C10H7NO4.

Это соединение заинтересовало группу исследователей во главе с S. Lepkovsky и соавт. [47]. В условиях накопления в организме избыточного количества жирных кислот и триптофана на фоне дефицита витамина В6 (пиридоксин) отмечалось усиленное образование ксантуреновой кислоты в тканях. Это сопровождалось появлением у животных признаков, характерных для сахарного диабета [28, 32, 33, 37, 71].

Ксантуреновая кислота является продуктом измененного обмена триптофана, в обычных условиях подвергающегося ме- таболизации по серотониновому и кинурениновому путям (рис. 1), которые при этом завершаются формированием соответственно 5-оксииндолуксусной кислоты и НАДФ [30]. Недостаток пиридоксаль-5-фосфата (П-5-Ф), вызываемый дефицитом витамина В6, ведет к угнетению 5-окситриптофандекарбок- силазы и кинурениназы, что сопровождается подавлением процессов метаболизации по обоим путям. В результате образуются 4 соединения: ксантуреновая кислота и 8-оксихинальдин из

Ключевыми ферментами в образовании ксантуреновой кислоты являются кинуренинаминотрансфераза и окситриптофандекарбоксилаза, коферментом которых служит П-5-Ф [49, 65]. Под влиянием кинуренинаминотрансферазы из 3-оксикинуренина образуется ксантуреновая кислота. При недостаточности в организме П-5-Ф образование серотонина снижается, а синтез ксантуреновой и кинуреновой кислот возрастает [47, 68]. Однако здесь возникает, казалось бы, противоречие: почему дефицит П-5-Ф тормозит синтез серотонина и стимулирует образование ксантуреновой кислоты? С одной стороны, это объясняется тем, что пиридоксалевые ферменты системы межуточного обмена триптофана по-разному реагируют на дефицит П-5- Ф: если активность кинурениназы снижается на 83%, то кинуренинаминотрансферазы - всего на 42% [76]. С другой стороны, при изучении локализации ферментных систем в клетках печени и почек было установлено, что кинуренинаминотрансфераза находится как в митохондриях, так и в растворимой части клетки, тогда как кинурениназа - только в растворимой части клетки. При недостатке П-5-Ф в организме содержание этих двух ферментов в растворимой части клетки существенно снижается, а уровень митохондриальной кинуренинаминотрансферазы остается прежним [44]. Этим объясняется увеличение выделения с мочой ксантуреновой кислоты. Впервые повышенные количества ксантуреновой кислоты были обнаружены в моче белых крыс, содержавшихся на рационе, богатом триптофаном и лишенном витамина В6. Добавление витамина к пище сопровождалось исчезновением ксантуреновой кислоты из мочи [30, 70]. Однако при далеко зашедшем авитаминозе В6 происходит снижение активности кинуренинаминотрансферазы, что сопровождается уменьшением ее выделения с мочой [78]. Позднее ксантуреновая кислота была обнаружена в моче у кроликов, собак, морских свинок и у человека [21, 23, 28].

Повышенное выделение ксантуреновой кислоты с мочой отмечается у больных сахарным диабетом в среднем и пожилом возрасте. У лиц пожилого возраста [20] с мочой выделяются повышенные количества ксантуреновой и кинуреновой кислот.

<- угнетение активности

Ч-- незначительное угнетение активности

ч- - сохранение активности

Несмотря на то что дополнительным введением пиридоксина в организм можно снизить уровень этих веществ в моче, полной нормализации их выделения добиться не удается [20]. Выделение ксантуреновой кислоты из организма идет через почки. Средняя концентрация ее в организме здоровых лиц в суточной моче колеблется от 2,1 до 8,8 мг [64].

Дефицит П-5-Ф в организме развивается в результате недостатка витамина В6 в пище или вследствие нарушений синтеза П-

В большинстве случаев нарушения межуточного обмена проявляются в виде усиленного расщепления триптофана с образованием избыточных количеств ксантуреновой кислоты. Причиной нарушенного межуточного обмена триптофана является недостаточное содержание П-5-Ф в организме [68].

Приближая условия опыта к более естественным, Y. Kotake [37] рекомендовал специфическую диету, усиливающую образование ксантуреновой кислоты, что приводило к развитию диабета. Процентный состав диеты был следующим: казеин - 22, солевая микстура McCollumn - 6, агар-агар - 3, дрожжи - 2, масло - 10, сахар - 5, крахмал - 52. Данная диета включала в свой состав большинство вышеназванных жирных кислот, каждая из которых вызывала увеличение экскреции ксантурсно- вой кислоты с мочой в 3,5-6,5 раза по сравнению с диетой, содержавшей только триптофан.

Показано, что биосинтез П-5-Ф зависит от содержания жира или жирных кислот в пище: при употреблении жирной пищи активность пиридоксальаминотрансферазы печени у интактных крыс снижается [56]. За счет ускорения кинуренинового пути обмена триптофана его диабетогенные метаболиты могут накапливаться при стрессе [1-3]. Между тем инъекция 10 мг витамина В6 в условиях опыта уменьшала экскрецию ксантуреновой кислоты до 2,03 мг [41]. Без введения витамина В6 количество выделенной за 24 ч у крыс кислоты составило 8,42 мг. Y. Kotake в 1968 г. установил, что жирные кислоты подавляют образование П-5-Ф из витамина В6 и тем самым инициируют нарушения триптофанового обмена, что усиливает образование ксантуреновой кислоты. Внутрибрюшинное введение мышам 200 мг/кг эндогенно образуемой ксантуреновой кислоты сопровождалось развитием сахарного диабета [40]. Удалось получить временную гипергликемию у кроликов путем введения им ксантуреновой кислоты [39]. Однако синтетическая ксантуреновая кислота в дозе 200 мг/кг не вызывала у собак и кроликов развития диабета [77]. В то же время, если животные предварительно получали большое количество жира, то назначение ксантуреновой или кинуреновой кислоты сопровождалось гипергликемией и развитием гистологических изменений, типичных для экспериментального сахарного диабета [29, 48, 49, 73, 77]. Между тем не удалось вызвать нарушения углеводного обмена у крыс и кроликов при однократном или повторном назначении им ксантуреновой кислоты или при содержании их на диете, лишенной витамина В6 [22].

Использование диеты, содержавшей триптофан в количестве 10 мг/кг, в сочетании с гиповитаминозом В2 [37] сопровождалось развитием гипергликемии и ксантуренурии. Аналогичный результат был получен при использовании 10 мг/кг триптофана на фоне гиповитаминоза В6. В последующем к диете Y. Kotake добавлял в рацион животных витаминную смесь, а именно: витамин В] - 3,3 у, никотиновая кислота - 10,0 у, холин - 16,6 у, инозитол - 333,0 у, Р-аминобензойная кислота - 200,0 у, рибофлавин - 6,6 у. У крыс, содержавшихся на диете по методу Y. Kotake, через 1 ч уровень гликемии значительно повышался. В последующем гипергликемия принимала стойкий характер. Параллельно возникали симптомы глюкозурии и полиурии. У животных появлялась склонность к увеличению массы тела, в среднем от 140 до 220 г, с последующим развитием ожирения до 260 г. Уровень ксантуренурии за 1 сут составлял в среднем 2-3 мг [41].

Исследование гистроструктуры срезов ткани поджелудочной железы подопытных животных позволило выявить заметные изменения в В-клетках панкреатических островков. Обнаруживались слабоокрашенные и умеренно гранулированные В-клетки, вакуолизация и разрушение цитоплазмы, гидропическая дистрофия, изменения ядер [14, 31, 33, 35, 37].

Установлено, что повышение уровня глюкозы крови, помимо ксантуреновой кислоты, вызывает кинуреновая кислота [52], конечным продуктом которой является хинальдиновая кислота [69]. Ксантуреновая кислота бесферментативным путем превращается в конечный продукт обмена - 8-оксихинальдиновую кислоту [70], которая обладает диабетогенными свойствами. Другие триптофановые метаболиты, такие как хинальдиновая, ксантуреновая и кинуреновая кислоты, обладают инсулиносво- бождающей активностью [58, 59]. Это проявляется массивным освобождением инсулина из изолированных островков в первые 30 мин после начала инкубации и незначительным - в последующий час. Присутствие хинальдиновой кислоты практически полностью подавляет вторую фазу освобождения инсулина [58]. При инкубации инсулина и ксантуреновой кислоты образуется стойкий комплекс, выделенный на сефадексе [41, 43]. Флюори- метрические исследования указывают на связывание двух молей ксантуреновой кислоты с димером инсулина. Гормональная активность этого комплекса составляет лишь 49% активности нативного инсулина [41, 42] и возрастает при добавлении в среду ионов цинка [43, 44, 72].

Е. Murakami [53, 54] показал, что инкубация ксантуреновой кислоты с инсулином сопровождается образованием двух комплексов, которые ему удалось выделить и очистить. В одном из них инсулин связан с 1 молем ксантуреновой кислоты, в другом - уже с 1,5. Вероятно, подобные комплексы, активность которых составляет лишь 50% активности инсулина, могут образовываться не только in vitro, но и в организме. Ксантуреновая кислота легко соединяется с инсулином в сыворотке крови, не нарушая при этом структуру инсулина. Этот комплекс отличается значительной стабильностью [41]. Полагают, что связь осуществляется за счет атома цинка с имидазольной группой в молекуле инсулина [40, 41]. Ксантуреновая кислота проявляет особую тропность к ионам цинка [26]. Добавляя ионы цинка к сыворотке крови, содержащей комплексы ксантуреновой кислоты и инсулина, удалось восстановить активность гормона [45].

Приведенные выше данные о диабетогенных свойствах ксантуреновой кислоты интересны прежде всего тем, что в отличие от других диабетогенных химических соединений ксантуреновая кислота способна образовываться и образуется в организме человека и животных при относительно несложных нарушениях диеты, а также при дефиците витамина В6.

О диабетогенном действии производных 8-оксихинолина

Известно, что как химическое соединение ксантуреновая кислота относится к производным 8-оксихинолина (рис. 2). Между тем К. Okamoto и I. Kadota [27, 61, 62] удалось вызвать экспериментальный диабет с помощью 8-оксихинолина. К. Okamoto [59] показал, что 8-оксихинолин и несколько его производных способны вызывать тяжелый диабет. Позднее было установлено, что многие другие дериваты 8-оксихинолина обладают диабетогенными свойствами: 8-пара(толуолсульфонила- мино)хинолин, 8-пара(бензолсульфониламино)хинолин, 8-па- ра(метансульфониламино)хинолин, 5-пара(ацетаминофенила- зо)-8-оксихинолин, 8-гидроксихинальдин и 5-амино-8-гидро- ксихинолин. Парентеральное введение этих веществ в дозах от 30 до 100 мг/кг сопровождалось быстрым (в течение 1-3 сут) развитием тяжелого экспериментального диабета [9, 25, 46].

Было обращено внимание на тот факт, что 8-оксихинолин является комплексобразующим соединением. Еще в 1947 г. A. Albert [17] сообщил, что 8-оксихинолин, который сам по себе не является токсичным соединением, в присутствии ионов металлов становится весьма токсичным для клеток; 6 его изомеров, не содержавших в положении 8 активных групп, не были способны образовывать хелатные комплексы с металлами и не являлись токсичными для клеток. G. Zentmyer [80] выдвинул предположение о том, что токсический эффект 8-оксихинолина является результатом его способности связывать и выводить из клеток ионы металлов. Однако S. Rubbo и соавт. и A. Albert и соавт. [18, 68] установили, что токсический эффект 8-оксихино- лина связан с его способностью образовывать комплексные соединения с ионами металлов. Обнаружено, что хелаты, состоящие из 1 молекулы 8-оксихинолина и 1 атома металла (1:1), являются наиболее токсичными для клеток [17].

Исследования механизмов диабетогенного действия производных 8-оксихинолина Я. А. Л азарисом и соавт. [8-11] показали, что только его производные, имевшие в положении 8 их молекулы гидроксильную или другую активную группу, содержавшую атомы серы или кислорода, могли вызывать экспериментальный диабет благодаря способности формировать токсичные комплексы с ионами цинка в цитоплазме В-клеток. Экстракция этих групп из положения 8 или их инактивация со-

NH

I

O2S - Zn

I

сн3

СН3

О2S -Zn

д                                    е

провождались полным исчезновением диабетогенных свойств производных 8-оксихинолина, включая ксантуреновую кислоту [38]. Необходимо было вернуть активную группу в положение 8, чтобы восстановить диабетогенную активность ксантуреновой кислоты. Детальное изучение динамики образования и диссоциации комплексов в цитоплазме В-клеток показало, что они формируются сразу после инъекции и полностью распадаются через 1,5-2 ч после образования, причем ионы цинка остаются в цитоплазме В-клеток и способны к повторному связыванию с диабетогеном [12]. Установлено, что присутствие хелатов в цитоплазме В-клеток в течение первых 15-20 мин после их формирования ведет к развитию тяжелых и необратимых изменений в клетке с развитием первичной инсулиновой недостаточности в течение 1-2 дней [12, 13].

Интересным является тот факт, что некоторые из диабетогенных производных 8-оксихинолина формируют с ионами цинка комплексы, способные давать яркую люминесценцию в ультрафиолетовых лучах. Это обстоятельство было использовано в качестве основы для разработки строго специфичных и высокочувствительных гистохимических люминесцентных методов выявления ионов цинка в цитоплазме В-клеток и в других тканях, содержащих ионы этого металла [4].

О механизмах диабетогенного действия ксантуреновой кислоты

Более 40 лет тому назад Y. Kotake обратил внимание на большое сходство химического строения молекулы ксантуреновой кислоты с другими диабетогенными производными 8-оксихи- нолина. Он предположил, что активная ОН-группа в положении 8 молекулы ксантуреновой кислоты имеет связь с ее диабетогенными свойствами [34, 36]. В 1957 г. Y. Kotake и М. Kato подтвердили тот факт, что ксантуреновая кислота обладает диабетогенными свойствами лишь в том случае, если в положении 8 хинолинового кольца фиксирована ОН-группа. Экстракция

Дефицит витамина В6 + богатая жирами пища

Дефицит витамина В(

Богатая жирами пища

Дефицит П-5-Ф

By Y.Kotake и соавт., 1975

___ i____

Синтез ксантуреновой кислоты (КК)

___________ у

Синтез кинуреновой, хинальдиновой и 8-оксихинальдиновой кислот

Связывание КК с инсулином

Образование комплекса КК-инсулин

i

Снижение активности инсулина

Перенапряжение В-клеток

Повреждение В-клеток

у

Образование токсического комплекса KK-Zn в клетках

Разрушение В-клеток

8-оксихинальдин

у

Угнетение синтеза проинсулина и формирования В-гранул t Перенапряжение В-клеток

i

Усугубление диабета

ДИАБЕТ

Рис. 3. Схема механизмов диабетогенного действия ксантуреновой кислоты.

или замена ее другой группой сопровождались полной потерей ею диабетогенных свойств [38].

Е. Murakami и Y. Kotake исследовали взаимодействие между инсулином и ксантуреновой кислотой. Впервые доказательства способности ксантуреновой кислоты связывать инсулин в опытах in vitro были представлены Е. Murakami [44]. Комплекс был выделен на сефадексе.

На основе полученных результатов Y. Kotake, Т. Ueda и соавт. предложили в виде следующей схемы свой взгляд на понимание механизмов диабетогенного действия ксантуреновой кислоты (рис. 3, левая часть).

Т. Ueda и соавт. [72] попутно обнаружили, что после диссоциации комплекса ксантуреновая кислота-инсулин формируется новый комплекс ее с ионами цинка, однако соответствующего внимайия данному факту не придали, и это соединение не было исследовано. В опытах in vitro было показано, что ксантуреновая кислота связывает цинк В-клеток, одновременно оказывая непосредственное повреждающее влияние на них [14, 50, 51].

Дефицит витамина В6 усиливает образование не только ксантуреновой кислоты. Конечным продуктом является 8-окси- хинальдиновая кислота, образующаяся из ксантуреновой кислоты, тогда как кинуреновая кислота превращается в хинальдиновую кислоту. Оба этих соединения обладают инсулиносво- бождающей активностью, стимулируя освобождение инсулина из изолированных панкреатических островков [59]. С другой стороны, эти метаболиты тормозят формирование В-гранул в результате блокирования ионов цинка в В-клетках. 8-Оксихи- нальдиновая кислота в этом отношении менее эффективна [60]. Кроме того, ксантуреновая кислота тормозит синтез инсулина в результате угнетения связывания инсулина с. цинком [63]. Между тем 8-оксихинальдин, являющийся дериватом 8-оксихинолина, обладает диабетогенными свойствами и способен вызывать гипергликемию и развитие дегенеративных изменений в В-клетках [61].

Диабет, вызываемый производными 8-оксихинолина, может быть предотвращен с помощью предварительного связывания островкового цинка недиабетогенными комплексобразую- щими веществами либо путем мобилизации ионов этого металла из В-клеток перед введением диабетогенного комплексобра- зующего реагента. Предварительное связывание ионов цинка с недиабетогенным хелатообразователем при этом надежно защищает В-клетки от разрушения в течение 10-12 ч. Такой метод защиты, использовавшийся при изучении механизмов развития экспериментального диабета, не имеет реальной перспективы практического использования, равно как и метод мобилизации ионов цинка из В-клеток. Это связано с тем, что практически невозможно и нецелесообразно держать ионы цинка в В-клетках в постоянно связанном состоянии с недиабетогенными хе- латообразователями либо постоянно выводить ионы этого металла из цитоплазмы В-клеток. Таким образом, несмотря на то что путем предварительной элиминации или связывания островкового цинка с недиабетогенными комплексобразующими веществами в эксперименте удается в 95-100% случаев предупредить развитие диабета, вызываемого хелатообразователями, такой способ малопригоден в отношении ксантуреновой кислоты. Между тем известно, что образование в организме ксантуреновой кислоты может быть предотвращено или уменьшено путем введения витамина В6. Этот путь предупреждения развития ксантуренового диабета представляется, по-видимому, одним из более перспективных. Он, кроме того, не требует дополнительных исследований фундаментального характера, касающихся разработок, связанных с применением витамина В6.

В отличие от всех других моделей экспериментального диабета, вызываемого диабетогенными производными 8-оксихинолина, которые после одномоментного введения абсолютно диабетогенной дозы вещества уже через 1-2 сут приводят к разрушению большей части В-клеток и развитию тяжелого диабета, ксантуреновый диабет развивается постепенно, по характеру проявлений напоминая скорее диабет типа 2, а не типа 1, который вызывают другие дериваты 8-оксихинолина. Вероятно, это объясняется тем, что в результате нарушений триптофанового обмена ксантуреновая кислота образуется в небольших количествах, не способных вызвать одномоментно поражение большей части В-клеток, но синтезируется при этом постоянно, в течение длительного времени.

Интерес к диабету, вызываемому ксантуреновой кислотой, возрастает, если учесть следующие 3 обстоятельства.

Исследования механизмов диабетогенного действия ранее изученных диабетогенных производных 8-оксихинолина, которые не могут образовываться в организме и возможность поступления которых в организм человека крайне низка, имеют чисто теоретическое значение. Вместе с тем их результаты с учетом того, что ксантуреновая кислота является одним из дериватов 8-оксихинолина, позволяют глубже понять механизмы ее действия. Ксантуреновая кислота, таким образом, заставляет обратить на себя внимание как на фактор, который может иметь определенное значение в патогенезе сахарного диабета человека.

На основе анализа результатов, полученных на сегодняшний день, предлагается следующее понимание механизмов диабетогенного действия ксантуреновой кислоты (см. рис. 3).