Подавляющее большинство больных сахарным диабетом - СД (около 85%) страдают СД типа 2. В настоящее время полагают, что в патогенезе СД типа 2 основную роль играет не нарушение образования инсулина, а нарушение контроля инсулиновой секреции при действии естественных стимуляторов освобождения гормона [1]. Некоторые инсулиннезависимые формы диабета прямо связаны с преобладанием в крови веществ с контринсулярным эффектом [6]. Многие из этих веществ до сих пор не идентифицированы, и природа их остается неизвестной. Недавно нами было показано, что атерогенные фракции липопротеинов (ЛП) плазмы крови дают контринсулярный эффект, связанный со снижением поглощения глюкозы периферическими тканями, в первую очередь мышцами [3]. Показано, что ЛП низкой (ЛПНП) и очень низкой (ЛПОНП) плотности могут снижать продукцию инсулина р-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы [2|. Носителем контринсуляр- ного эффекта оказался апопротеин В (апоВ), входящий в состав ЛПНП и ЛПОНП. Целью данного исследования являлось изучение фрагмента аполипопротеина В, обладающего инсулиноподобной иммунореактивностью, поскольку ранее было показано, что он является продуктом лимитированного протеолиза апоВ [2, 3]. Материалы и методы В контрольную группу вошли 17 человек в возрасте 40-61 года с показателями углеводного и липидного обменов в пределах возрастной нормы. Больные СД типа 2 находились на лечении в клинике Научного центра клинической и экспериментальной медицины: всего обследовано 40 человек в возрасте 45-71 года (средний возраст 54,9 ± 5,4 года), из них 16 женщин и 24 мужчины. Относительную массу тела оценивали по индексу Кетле, который рассчитывали по формуле: масса тела (в кг)/рост (в м)2. Ранее методами иммунохимического анализа было выявлено присутствие общих антигенных детерминант в молекулах апоВ-100 и инсулина [2]. После этого был выбран один из пептидов (продуктов лимитированного протеолиза апоВ), обладающий инсулиноподобной иммунореактивностыо. Мы обозначили его как "пептид В". Инсулиноподобная иммунореактивность была идентифицирована при электрофорезе апоВ в ПААГ с последующим иммуноблоттингом с антителами к инсулину [2, 3). В нашей работе неокрашенные участки геля, содержащие исследуемый пептид, измельчали в гомогенизаторе в 0,15 М NaCI и использовали для иммунизации животных. С целью получения специфических поликлональных антител кроликов иммунизировали по схеме, описанной нами ранее [5]. Пептид В, выделенный методом электрофоретического элюирования, использовали также в дальнейшей работе при проведении твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА). Концентрацию белка определяли по Лоури, используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта [10]. Иммуноглобулины из сыворотки крови выделяли осаждением с помощью сульфата аммония. Осадок отделяли центрифугированием. Операцию повторяли 3-4 раза. Полученный препарат диализовали против 0,01 М фосфатного буфера pH 7,4. Заключительную очистку IgG проводили с помощью хроматографии на анионообменнике DEAE-Toyopearl 650 M"TSK" (Япония). Для идентификации антител к пептиду В использовали реакцию двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони [11]. Для тИФА использовали аполипопротеины В- 100 и В-48. С этой целью ЛПОНП и ЛПНП выделяли методом препаративного ультрацентрифугирования [8] в растворах КВг на центрифуге "Beckman L5-75" (США). Дел и лидирование проводили охлажденной смесыо хлороформ-метанол (1:1) с последующей многократной отмывкой эфиром. Аполипопротеины разделяли методом гель-фильтрации на Сефарозе CL-6B |5]. Чистоту аполипопротеинов исследовали методом диск-электрофореза [9]. Для получения сыворотки крови, не содержащей ЛП, последние удаляли методом ультрацентрифугирования, а также путем осаждения ЛПОНП и ЛПНП гепарином в присутствии СаС12 по Бурштейну [7]. Иммуноферментный анализ на твердой фазе проводили в полистироловых планшетах "Nunk" (Дания). Пептид В в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ) pH 7,4 в концентрации 10 мкг/мл наносили на планшет по 100 мкл в лунку и инк^ировали при 4°С в течение ночи. После инкубации планшеты трижды отмывали 0,01 М ФСБ, содержащим 0,05% твин-20 (ФСБТ). Незанятые места сорбции блокировали 10% нормальной лошадиной сывороткой, содержащей 0,05% раствор лактальбумина. В подготовленные таким образом планшеты добавляли по 100 мкл специфических антител при последовательном двукратном разведении ФСБТ, начиная с разведения 1:100. Продолжительность инкубации антител с пептидом В составляла 1 ч при 37°С. Избыток антител удаляли троекратным промыванием ФСБТ. Для насыщения связавшихся антител использовали козьи антитела к IgG кролика (вторые антитела), меченные пероксидазой хрена ("Sigma", США). По 100 мкл раствора вторых антител добавляли в каждую ячейку в разведении 1:1000. Планшеты инкубировали 1 ч при 37°С. После 5-кратного промывания ФСБТ проводили ферментативную реакцию. Для этого в ячейки вносили по 200 мкл свежеприготовленного субстрата - ортофенилендиамина ("Merk", ФРГ) в концентрации 20 мг на 100 мл 0,1 М фосфат-цитратного буфера pH 5,0, содержащего 0,006% раствора перекиси водорода. Через 15 мин ферментативную реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1Н H2SO4. В качестве контрольных использовали ячейки, в которых вместо антигена добавляли по 100 мкл ФСБ. Результаты и их обсуждение Полученные кроличьи антитела к пептиду В были охарактеризованы с помощью двойной радиальной иммунодиффузии. На рис. 1 видно, что антитела давали одну полосу преципитации с пептидом В (7-4, титр 1:32). С ЛПОНП, ЛПНП и сывороткой крови антитела не реагировали, вероятно, в связи с тем, что метод Оухтерлони позволяет выявлять достаточно большие количества антигена. Кроме того, соответствующие антигенные детерминанты в ЛПОНП и ЛПНП могут быть экранированы липидной фазой. В дальнейшем изучение антител к пептиду В проводили с помощью непрямого тИФА, который отличается высокой по сравнению с двойной ради-алычой иммунодиффузией разрешающей способностью (до 50 пг). Для установления оптимального разведения антител на планшеты сорбировали избыточное количество пептида В (1 мкг/100 мкл в ФСБ). Образцы антител раститровывали при последовательном двукратном разведении буфером, содержащим 0,05% твин-20. Далее методику проводили по схеме (см. раздел "Материалы и методы"). Конечный титр антител составил 1:20 000. На рис. 2 представлена кривая титрования антител к пептиду В. В наших условиях было найдено оптимальное разведение антител - 1:1000. Для установления рабочего режима метода планшеты инкубировали с растворами различных антигенов (пептид В, апоВ-100 и апо В-48) в концентрации 1, 2, 5, 10, 20, 50 и 100 нг/100 мкл в ФСБ. Вид калибровочной кривой зависел от выбранного антигена (рис. 3). Интенсивность ферментативной реакции в случае с апоВ-48 значительно уступала значениям оптической плотности при использовании в качестве антигенов пептида В и апоВ-100, калибровочные кривые которых были сходными. Кривые титрования цельной человеческой сыворотки, сыворотки после осаждения суммарной фракции ЛПОНП и ЛПНП по Бурштейну, а также сыворотки, лишенной всех ЛП в процессе ультрацентрифугирования, представлены на рис. 4. В связи с тем что цельная сыворотка содержала большое количество антигенных детерминант для исследуемых антител, в последней точке калибровочного графика (разведение 1:100 000) значение экстинции было достаточно высоким. Для получения графика стандартной формы требовалось еще большее разведение сыворотки, что, несомненно, приводило бы к потере достоверности результатов. Калибровочные кривые сыворотки без суммарной фракции ЛПОНП и ЛПНП, а также сыворотки, лишенной всех Л П, повторяли друг друга и имели более привычный вид. Таким образом, было решено в дальнейшем использовать для исследований сыворотку, лишенную суммарной фракции апоВ-содержащих ЛП (осаждение по Бурштейну), по причине простоты получения данного материала. Рабочее разведение материала составило 1:8000. При исследовании сыворотки крови на содержание пептида В оказалось, что его содержание в сыворотке больных СД типа 2 было достоверно выше по сравнению с таковым у здоровых доноров. Среднее значение в контрольной группе составило 1,83 ± 0,32 ммоль/л, а у больных СД типа 2 - 2,26 ± 0,35 ммоль/л (р < 0,05). С увеличением индекса массы тела содержание пептида В в сыворотке крови еще немного возрастало (2,33 ± 0,22 ммоль/л; р < 0,05). При длительности заболевания более 6 лет содержание пептида В увеличивалось, особенно у женщин (2,47 ± 0,42 ммоль/л; р < 0,01 по сравнению с контрольной группой). Ранее нами было показано, что наличие перекрестной иммунореактивности между инсулином и аполипопротеином В обусловлено наличием в структуре обоих соединений общего эпитопа. В инсулине он располагается в рецепторно-значимой области |4|. В аполипопротеине В он находится в N- терминальном конце, однако точная локализация его не установлена. Именно их общий эпитоп определяет наличие конкурентных взаимоотношений между инсулином и аполипопротеином В в борьбе за инсулиновый рецептор. Пептид В - это фрагмент аполипопротеина В, содержащий данный эпитоп. Мы предполагаем, что выделенный нами пептид В и апоВ-содержащие ЛП, обладающие инсулинопо- Рис. 4. Кривые титрования цельной сыворотки, сыворотки после осаждения суммарной фракции ЛПНП и ЛПОНП. сыворотки без ЛП антителами к пептиду В. / - цельная сыворотка; 2 - сыворотка после осаждения ЛПОНП и ЛПНП; 3 - сыворотка после удаления всех ЛП путем ультрацентрифугирования. По оси абсцисс - разведения сыворотки. добной иммунореактивностыо и контринсулярным эффектом, являются одной из возможных причин развития СД типа 2. Кроме того, обладая способностью снижать продукцию инсулина р-клетками островков Лангерганса, апоВ-содержащие ЛП усугубляют течение инсулинзависимого диабета [2]. Выводы 1. Получены специфические антитела к фрагменту аполипопротеина В (пептид В), обладающему инсулиноподобной иммунореактивностью. 2. Антитела к пептиду В в ИФА реагировали с аполипопротеином В-100, цельной сывороткой, сывороткой после осаждения суммарной фракции - ЛПНП и ЛПОНП и с сывороткой после удаления всех Л П путем ультрацентрифугирования. 3. По сравнению со здоровыми донорами содержание пептида В в сыворотке крови больных СД типа 2 было достоверно выше. С увеличением длительности заболевания содержание пептида В возрастало.