Щитовидная железа продуцирует тироксин (Т4) и небольшую фракцию активного тиреоидного гормона 3,3’,5-трийодтиронина (Т3), который опо­средует влияние тиреоидных гормонов на рост, дифференциацию, энергетический метаболизм. Т4 метаболизируется двумя 5’-дейодирующими энзи­мами: типов I и II. Эти энзимы кодируются двумя генами, регулируются различными способами и экспрессируются в различных тканях.

5'-дейодиназа I (Д1) преимущественно дейоди- рует обратный Т3 (оТ3), а также Т4 с константой Михаэлиса (КМ) в микромолярном ряду. 5'-дейо- диназа II (ДП) предпочитает Т4, а не оТ3 в качестве субстрата КМ в наномолекулярном ряду [2].

Хорошо изученная Д1 в основном локализована в печени, почках, щитовидной железе, эутиреоид­ном аденогипофизе и мозге. Печень производит 70—80% циркулирующего Т3 за счет 5'-дейодирова- ния. Почки и щитовидная железа продуцируют меньшие количества циркулирующего Т3. Природа секретируемого из щитовидной железы Т3 проти­воречива. До сих пор неясно, прямо ли происходит Т3, секретируемый щитовидной железой, из не полностью йодированного тироглобулина или ло­кально за счет Д1 в тироцитах.

Активность тиреоидной Д1 изменяется при различных патофизиологических условиях, т. е. и тиреотропный гормон (ТТГ), и стимулирую­щие ТТГ-рецептор антитела приводят к увеличе­нию активности 5'-дейодиназы в щитовидной железе человека и крыс. Эти данные предполага­ют регуляцию Д1 через ТТГ-рецептор G, адени- латциклазу, цАМФ-путь. Показано, что стимуля­ция Д1 через систему цАМФ имеет место в щи­товидной железе, но не в печени, почках, гипо­физе и мозге [2].

ДП обеспечивает внутриклеточный пул Т3 в гипофизе, мозге, бурой жировой ткани и плацен­те и является ключевым регуляторным элемен­том в локальном тиреоидном гомеостазе. Недав­но активность ДП найдена в щитовидной железе человека, но не крыс, т. е. этот фермент является видоспецифичным [1]. Одним из наиболее уди­вительных аспектов ДП является различие тка­невой специфической экспрессии у человека и крыс. ДП экспрессируется в ЦНС, гипофизе, бу­рой жировой ткани и плаценте человека и крыс, но не в щитовидной железе, скелетной и сердеч­ной мышцах крыс. Хотя предполагалось, что ДП обеспечивает первоначально внутриклеточный Т3, сейчас рассматривается возможность того, что у человека ДП может обеспечивать плазмен­ный Т3 [5].

В связи с последними данными возникает во­прос о биологической природе мРНК ДП. Актив­ность ДП стимулируется агентами, увеличивающи­ми продукцию цАМФ, — кортикостероидами (дек­саметазон), а также разными факторами роста. По­добно Д1, ДП — мембранно-связанный белок, ло­кализованный в плазматической мембране. Кле­точная и тканеспецифичная экспрессия Д1 и ДП различна. Нет убедительных доказательств того, изменяется ли экспрессия двух энзимов при транс­формации [4]. В связи с этим целью данной работы явилось изучение экспрессии ДП и ДП в норме и при различных опухолях щитовидной железы.

Материалы и методы

Мы использовали 18 образцов щитовидной же­лезы: 10 из опухолей и 8 из нормальных, окружаю­щих узлы, тканей щитовидной железы. РНК выде­ляли с помощью коммерческого реактива Trifast (Германия). Обратную транскрипцию (ОТ) выпол­няли с Oligo-dT (12—18) ("Life Technologies") как праймером. Для каждой полимеразной цепной ре­акции (ПЦР) использовали 1 ц1 кДНК. Амплифи­кацию выполняли с помощью Taq DNA Polymerase ("Quiagen", Германия). Использовали праймеры для р-актина коммерческой фирмы "Stratagen" (Германия). Праймеры для амплификации Д1 и ДП (см. таблицу) были синтезированы в лаборатории проф. J. Kohrle.

Условия для ПЦР следующие: нагревание при 95°С, денатурация при 95°С 45 с, отжиг при 60°С для р-актина, при 62’С для Д1, при 58°С для ДП в течение 45 с и элонгация при 72°С в течение 60 с. Для Д1 и ДП проводили 35 циклов амплификации, для р-актина 25 [7]. После амплификации 10 ц1 ПЦР-продукта анализировали в 1,5% агарозном геле.

Результаты

Выделенные из тканей РНК методом ОТ-ПЦР были транскрибированы до кДНК. Для доказатель­ства успешности выделения РНК и ОТ был ампли- фицирован р-актин. На рисунке видно, что во всех пробах p-актин-продукт был обнаружен на агароз­ном геле, окрашенном бромидом этидия, после 25 циклов амплификаций. ОТ-ПЦР-амплификация РНК, выделенных из всех тканей щитовидной же­лезы, дала полосы, соответствующие 777 п. н. для Д1 и 796 п. н. для ДП, что согласуется с данными литературы [7].

Обсуждение

В данной работе мы пытались обнаружить раз­личия в регуляции активации тиреоидных гормо­нов при опухолях щитовидной железы, которые могут терять свою зависимость от Т3, образованно­го 5’-дейодированием, контролирующего зависи­мые от Т3 рост, пролиферацию и дифференциацию щитовидной железы. Большинство опухолей щито­видной железы происходят из фолликулярного эпителия и демонстрируют либо фолликулярную, либо папиллярную архитектуру. Ранее при опухо­лях щитовидной железы обнаружено снижение экспрессии Д1 в фолликулярной тиреоидной кар­циноме и очень низкий или необнаруживаемый уровень активности Д1 при анапластической ти­реоидной карциноме [6]. Также снижение актив­ности обнаружено в большинстве случаев папил­лярной карциномы с некоторыми исключениями, показывающими активность выше нормы [6].

В нашей работе короткие фрагменты мРНК ДП, кроме мРНК Д1, в щитовидной железе человека были получены с использованием ОТ-ПЦР, кото­рая позволяет идентифицировать достоверные транскрипты. Гель-электрофорез показывает раз­личный уровень экспрессии ПЦР-продуктов для Д1 и ДП при различной тиреоидной патологии, от­мечая регуляцию для Д1 и ДП на уровне мРНК.

При изучении экспрессии генов Д1 и ДП пока­зано нарушение регуляции экспрессии на уровне транскрипции, т. е. обнаружено визуальное умень­шение мРНК для генов Д1 и ДП. Возможно, суще­ствует обратная корреляция между экспрессией этих генов и клеточной пролиферацией в эпители­альных клетках щитовидной железы. Экспрессия для Д1 и ДП мРНК нарушается от степени диффе­ренциации опухоли — от фолликулярной, папил­лярной до анапластической карциномы. В настоя­щее время обсуждается возможное использование экспрессии Д1 как дифференциального маркера для рака щитовидной железы [3]. Нарушение экс­прессии Д1 и тесно связанной с ней продукции Т3 в процессе дедифференциации может быть одним из молекулярных дефектов контроля роста и уве­личивающейся тенденции к инвазии. Мы не нашли корреляции или параллелизма в экспрессии Д1 и ДП мРНК в различных образцах щитовидной же­лезы (см. рисунок). Нарушение уровня мРНК ДП было обнаружено в 3 образцах (N 1310, 1296, 1294) при аденоме и в 1 (N 457) — при папиллярной кар­циноме по сравнению с их собственными нормаль­ными, окружающими узлы тканями. Считается, что экспрессия ДП мРНК в щитовидной железе че­ловека регулируется еще не известными факторами и предполагает различный механизм регуляции ДП по сравнению с Д1. Независимо от этого можно сделать заключение о наличии экспрессирующихся генов обеих 5'-дейодиназ (типов I и II) в тканях ти­реоидной карциномы. Наши данные показали, что экспрессия малоизученной ДП в патологических

123456789                                        10     11

661 п.н.

а

661 п.н.

777 п.н.

777 п.н.

796 п.н.

в

796 п.н.

1   2 3 4 5 6 7 8

ПЦР для генов р-актина (о); Д1 (б) и ДП (в) (в скобках — но­мер соответствующего пациента).

а: 1 — аденома; 2 — норма (457); 3 — анапластическая карцинома; 4 — фоллику­лярная аденома (1296); 5 — норма (1310); 6 — норма; 7— аденома; 8 — норма; 9 — норма (1294); 10 — фолликулярная карцинома; 11 — капиллярная карцинома (1262); в: 7 — фолликулярная аденома (1310); 2 — норма (1296); 3 — норма; 4 — фолликулярная аденома (1294); 5 — папиллярная карцинома (457); 6 — норма; 7 — аденома; 8 — контроль (Н2О). малигнизированных тканях уменьшена по сравне­нию с нормальной тканью или доброкачественны­ми опухолями, что, возможно, связано с транс­крипционными механизмами.

Выводы

Выявлены нарушения регуляции экспрессии гена ДП в опухолях щитовидной железы на уровне транскрипции.