Исследованиями последних лет установлена важная роль одного из основных гуморальных ре­гуляторов пищевого поведения — холецистокини­на (ХЦК) — в стимуляции секреции инсулина [15, 17], а также доказано его участие в патогенезе са­харного диабета [3, 11, 16]. В настоящее время из­вестно, что молекула ХЦК, состоящая из 58 ами­нокислотных остатков, после секреции подвергает­ся ряду расщеплений с последовательным образо­ванием различных природных фрагментов, среди которых наибольшей биологической активностью обладают тетрапептид (30—33) и октапептид (26— 33) [3, 7]. Тетрапептид ХЦК (ХЦК-4) представляет собой конечный продукт процессинга ХЦК, актив­ный лишь в отношении рецепторов ХЦК 2-го типа (ХЦК2Я) [6, 9, 10], в то время как октапептид ХЦК (ХЦК-8) влияет как на 1-й (XHKjR), так и на 2-й тип рецепторов [3, 9, 14], являясь при этом основ­ной секретируемой формой ХЦК в мозге [5] и в окончаниях блуждающего нерва [7]. В наших пре­дыдущих работах показано, что развитие экспери­ментального сахарного диабета приводит к усиле­нию продукции ХЦК в гипоталамусе [2], а много­кратное интрацеребровентрикулярное и интрапе­ритонеальное введение ХЦК-4 крысам с диабетом ухудшает течение заболевания [1].

С целью определения роли ХЦК-8 в патогенезе сахарного диабета типа 1 мы изучили влияние мно­гократного интрацеребровентрикулярного и ин­траперитонеального введения этого фрагмента пептида на эндокринную функцию поджелудочной железы в норме и при экспериментальном диабете.

Материалы и методы

Исследование проведено на 80 половозрелых крысах линии Вистар. Все животные находились на стандартном рационе питания с ежедневным изме­рением количества потребляемой пищи. Сахарный диабет типа 1 моделировали однократным введени­ем стрептозотоцина ("Sigma Chemical", США) в до­зе 50 мг/кг внутрибрюшинно. Для изучения влия­ния ХЦК-8 на а- и р-клетки островков Лангерган­са использовали синтетический октапептид ХЦК 26—33 производства фирмы "Peninsula Laboratories Inc." (США). ХЦК-8 вводили ежедневно в течение 10 дней интраперитонеально (15 нмоль на 1 кг мас­сы тела в 1 мл 0,9% раствора NaCl) и интрацереб- ровентрикулярно (75 пмоль на 1 кг массы тела в 3 мкл 0,9% раствора NaCl). Введение пептида кры­сам с диабетом начинали на 25-е сутки после инъ­екции стрептозотоцина, так как уже к этому сроку у животных формировались все признаки сахарно­го диабета [1,4]. Для интрацеребровентрикулярных введений животным за 8 дней до начала экспери­ментов в правый латеральный желудочек мозга сте- реотаксически имплантировали стальную канюлю [12]. Контролем служили группы животных без диабета и с диабетом без введений, а также с вве­дениями эквивалентных количеств 0,9% раствора NaCl.

Через 24 ч после последнего введения пептида на фоне 16-часового голодания животных декапи- тировали под этаминаловым наркозом (40 мг/кг), быстро извлекали поджелудочную железу, которую после фиксации в жидкости Буэна и стандартной гистологической обработки заливали в парафин. Непосредственно перед забоем брали артериаль­ную кровь для определения концентрации инсули­на радиоиммунным методом с использованием на­бора рио-ИНС-ПГ-|251 (Институт биохимии НАН Республики Беларусь). Концентрацию глюкозы в периферической крови измеряли с помощью при­бора One Touch II® ("Life Scan", "Johnson and John­son”, США) через 16 ч после последнего приема пи­щи до начала введений ХЦК-8, а также непосред­ственно перед забоем.

Идентификацию р-клеток и количественное выявление инсулина в них осуществляли методом непрямой иммунофлюоресценции с использовани­ем набора фирмы "Peninsula Lab. Inc." (США) со­гласно прилагаемому протоколу. Для идентифика­ции а-клеток использовали первичные мышиные моноклональные антитела к глюкагону и вторич-

Таблица 1

Потребление пищи, концентрация глюкозы и инсулина в крови у экспериментальных животных (М ± т)

При ме ча ние. Здесь и в табл. 2: i. р. — интраперитонеальное введение, i. с. v. — интрацеребровентрикулярное введение. Звездочки — достоверность (р < 0,05) различий: одна — с интактными животными, две — с животными с диабетом.

Таблица 2

Показатели а- и р-клеток островков Лангерганса у экспериментальных животных (М ± т)

а-Клетки

ные кроличьи антитела к IgG мыши, конъюгиро­ванные с FITC ("Sigma Chemical’’, США).

Изображения островков, получаемые на микро­скопе AXIOSKOP ("Zeiss”, Германия), с помощью высокочувствительной видеокамеры COHU-4722 вводили в систему анализа изображений VIDAS- 386 ("Kontron Elektronik", Германия). В дальней­шем с помощью специальной программы в полу­автоматическом режиме измеряли среднее количе­ство а- и р-клеток в площади среза островка Лан­герганса, а также площадь, занятую иммунореак­тивным к гормону материалом, кон­центрацию и содержание инсулина и глюкагона. Значения этих показате­лей использовали для оценки актив­ности процессов синтеза и секреции гормона в клетках.

Микрофотографии получали с помощью видеопринтера СР 100 ("Mitsubishi”, Япония). Достовер­ность различий оценивали по /-кри­терию Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Проведенные исследования по­казали, что многократное интрапе­ритонеальное и интрацеребровен- трикулярное введение физиологиче­ского раствора здоровым крысам и животным с диабетом не вызывало достоверных изменений изучаемых нами показателей.

Интраперитонеальное введение ХЦК-8 в течение 10 дней вызывало достоверное снижение потреб­ления пищи, что сочеталось с уменьшением концентрации инсулина в сыворотке крови (табл. 1). В р-клетках достовер­но увеличивались площадь, концентрация и содержание гормона (табл. 2). Это, по всей видимости, свидетельствовало о торможении секреции инсу­лина и накоплении его в цито­плазме р-клеток, что хорошо видно на приведенной микро­фотографии (рис. 1, б). В ос- клетках отмечали практически аналогичные изменения, также свидетельствующие о торможе­нии секреции глюкагона. Дос­товерных изменений концен­трации глюкозы в крови не от­мечено.

Многократные интрацеребро- вентрикулярные введения ХЦК-8, как и интраперитонеальные вве­дения, вызывали снижение по­требления пищи, однако при этом концентрация инсулина в крови уменьшалась в большей степени, а уровень гликемии достоверно возрастал. В р-клет­ках происходило достоверное снижение всех изу­чаемых показателей, что выражалось в уменьше­нии площади клетки и интенсивности флюорес­ценции, хорошо видимых на микрофотографии (рис. 1, в). По всей видимости, причина этих изме­нений связана с угнетением не только секреции, но и синтеза инсулина. В а-клетках наблюдали досто­верное увеличение площади и снижение концен­трации глюкагона, что свидетельствовало о стиму­ляции его секреции и являлось причиной повыше­ния концентрации глюкозы в крови.

Таким образом, нами показано, что многократ­ное введение ХЦК-8 здоровым животным в отли­чие от описанных в литературе стимулирующих эффектов однократного введения [13] подавляло продукцию инсулина в р-клетках, что могло быть следствием длительной анорексии [8], обусловлен­ной влиянием изучаемого нами пептида. Кроме то­го, разные способы введения ХЦК-8 оказывали разнонаправленное действие на а-клетки остров­ков Лангерганса, снижая секрецию глюкагона при периферическом введении и стимулируя — при центральном.

Развитие сахарного диабета к концу 5-й недели вызывало снижение массы тела, развитие полифа­гии в сочетании с гипергликемией и выраженной гипоинсулинемией. В островках значительно умень­шалось количество р-клеток и увеличивалось коли­чество а-клеток (рис. 2, а). В сохранившихся р-клет­ках компенсаторно увеличивались площадь и содер­жание инсулина (рис. 3, а). В а-клетках достоверно возрастали площадь, содержание и снижалась кон­центрация глюкагона, что свидетельствовало о ха­рактерной для сахарного диабета активации синтеза и секреции глюкагона в островках Лангерганса.

При сахарном диабете интраперитонеальные вве­дения ХЦК-8 снижали гиперфагию и приводили к достоверному увеличению концентрации инсулина в крови и снижению уровня гликемии. Данные из­менения были связаны с усилением секреции инсу­лина в р-клетках, о чем свидетельствовало снижение в них концентрации и содержания гормона (рис. 3, б). В определенной мере этому также способствова­ло уменьшение количества а-клеток в островках и торможение в них синтеза и секреции глюкагона, что проявлялось достоверным снижением всех изу­чаемых показателей (рис. 2, б; см. табл. 2).

Центральное введение ХЦК-8 приводило к дос­товерному повышению концентрации инсулина в крови, однако снижало уровень гликемии в меньшей степени, чем при периферическом введении (см. табл. 1). Данные изменения могли быть связаны со стимуля­цией секреции инсулина в р-клет­ках (см. табл. 2), проявлявшейся уменьшением площади гормона до уровня интактных животных и снижением концентрации и со­держания инсулина в них (рис. 3, в), а также снижением количества а-клеток в островках Лангерган­са, уменьшением площади, со­держания и концентрации глюка­гона (рис. 2, в). Установленный положительный эффект мог быть также связан с угнетением по­требления пищи, которое было выражено в большей степени, чем при интраперитонеальном введе­нии ХЦК-8 (см. табл. 1).

Таким образом, многократное введение ХЦК-8 в отличие от ХЦК-4 [1] оказывало положи­тельное влияние на течение са­харного диабета, что проявля­лось повышением концентрации инсулина в кро­ви, снижением уровня гликемии и угнетением по­лифагии. Это связано с тем, что оба способа вве­дения активировали функцию р-клеток и подавля­ли патологически высокую активность а-клеток.

Выводы

Многократные центральные и перифериче­ские введения ХЦК-8 у животных с сахарным диа­бетом типа 1 улучшают течение заболевания, что выражается в снижении гликемии, стимуляции секреции инсулина и подавлении патологически высокой продукции глюкагона.