Кортикотропин-рилизинг-фактор (КРФ) и КРФ-подобные эндогенные гипоталамические нейропептиды играют ключевую роль в реакции организма на разнообразные стрессы [8, 13]. В организацию стрессовых реакций активно вовлекается экстра- гипоталамическая КРФ-система [12]. Она образована популя­циями нейронов различных структур мозга, продуцирующих КРФ [17], а также специфическими рецепторами. К настояще­му времени выделено 2 типа рецепторов: КРФ-1 и КРФ-2 [7, 15], причем КРФ-1-рецепторы, через которые опосредует свои эффекты КРФ, локализованы в коре, амигдале, обонятельной луковице и других структурах мозга [5, 16].

Экзогенное введение КРФ в мозговые структуры индуцирует разнообразный спектр поведенческих реакций, проявление кото­рых зависит от исходного функционального состояния животных и дозы гормона. В таких исследованиях можно выявить законо­мерность, согласно которой КРФ дозозависимо усиливает пове­денческие реакции [2, 8, 13]. Этот активирующий вектор дейст­вия КРФ на поведение означает наличие у него отчетливых ней­ротропных свойств. Внутрижелудочковое введение или микроап­пликация КРФ в отдельные области мозга, действительно, инду­цирует в них возбуждающие эффекты, что проявляется в увели­чении частоты спонтанных разрядов нейронов [3, 6, 9, 10, 18, 19]. Электрофизиологический механизм активирующего действия КРФ на экстрагипоталамические нейроны заключается, по-ви­димому, в деполяризации их цитоплазматической мембраны [3].

Несмотря на достигнутый прогресс в исследовании нейро­тропных эффектов КРФ, остаются неизвестными молекулярно­клеточные механизмы его взаимодействия с глутаматергической системой, широко представленной в мозге и являющейся одной из ключевых в развитии как нормальных, так и патологических процессов.

В данной работе представлены результаты исследований влияния экзогенного КРФ на электрофизиологические харак­теристики переживающих срезов обонятельной коры мозга крыс. Отметим, что в нижнем этаже этой сенсорной системы - обонятельной луковице - выявлены нейроны, продуцирующие КРФ, а также рецепторы типа КРФ-1 [5, 16, 17]. В обонятельной коре также обнаружено 2 подтипа глутаматных ионотропных ре­цепторов: а-амино-3-гидрокси-5-метил-изоксазол-4-пропио- новые (АМПА) и N-MeTwi-D-аспартатные (НМДА) [1]. Изучить влияние КРФ на эти рецепторные системы, учитывая, что глу­тамат является основным возбуждающим медиатором в мозге, на ГАМК-тормозные системы, а также на длительную постте­таническую потенциацию, рассматриваемую как модель обуче­ния и формирования энграммы памяти, было целью наших ис­следований.

Материалы и методы

Работа проведена на тангенциальных переживающих срезах обонятельной коры мозга крыс толщиной 400-500 мкм (рис. 1, ci). Состав инкубационной среды (в мМ): NaCl - 124; КС1 - 5; СаС12 - 2,6; КН2РО4- 1,24; MgSO4 - 1,2; NaHCO3- 3; глюкоза - 10; трис-НС1 - 23. Раствор тщательно насыщали кислоро­дом, температуру поддерживали на уровне 37°С, pH 7,2-7,3. Срез перфузировали со скоростью 2 мл/мин. Эффекты КРФ ("Sigma") исследовали в концентрации 5 • 10"8 и 5 • 10 0 М.

До начала тестирования в срезах регистрировали контроль­ные фокальные потенциалы (ФП) на одиночные ортодромные

Рис. 1. Схема среза обонятельной коры мозга крыс (а) и схема ФП, регистрируемого в нем (б).

а - структуры мозга, входящие в срез, вид с пиальной поверхности: 1 - латераль­ный обонятельный тракт; 2 - периформная кора; 3 - обонятельный бугорок; 4 - часть кортикального амигдалярного ядра; 5- граница среза; локализации стимули­рующего (СЭ) и регистрирующего (РЭ) электродов; б - схема ФГ1 с указанием со­ответствующих компонентов. Пунктир - изолиния. Стрелки - измерения ампли­туд компонентов ФП. Полярность колебаний: негативность - вверх, позитивность - вниз от изолинии. раздражения латерального обонятельного тракта (ЛОТ) с интер­валом 5 мин. Затем перфузия переключалась на среду с КРФ в одной из концентраций. Длительность тестирования составляла 20 мин. В течение этого времени с интервалом 5 мин регистри­ровались ФП в ответ на одиночные раздражения ЛОТ. Вслед за этим в течение 15 мин проводили отмывание срезов контроль­ной средой.

Анализировали амплитуды возбуждающих и тормозных по­тенциалов, имеющих различную рецепторную организацию и ионные механизмы генеза (рис. 1, б). Возбуждающие потенциа­лы - пресинаптический компонент (ПД ЛОТ) - свидетельст­вуют о прохождении возбуждения по волокнам ЛОТ. Постси­наптические возбуждающие потенциалы (ВПСП) опосредова­ны неМ-метил-Э-аспартатом (неНМДА) и НМДА-компонента- ми ВПСП. Первый из них связан с активацией АМПА-рецеп- торов, второй - с НМДА-рецепторами. Среди тормозных пост­синаптических потенциалов (ТПСП) регистрировали и анали­зировали медленный ТПСП (ТПСПМ) (см. рис. 1, б). Генерация этого потенциала связана с активацией ГАМКБ-рецепторов и сопряженных с ними хлорных токов. Быстрый ТПСП (ТПСПб) в данной работе не анализировали, поскольку его возникнове­ние было нестабильным. Способы измерения амплитуд соответ­ствующих компонентов ФП указаны стрелками на рис. 1, б.

Статистическую обработку полученных результатов прово­дили с применением методов непараметрической статистики, а также с использованием г-критерия.

Результаты и их обсуждение

Как показали проведенные исследования, КРФ в концен­трации 10_8М вызывал активацию пре- и постсинаптических возбуждающих компонентов ФП. Эффекты возникали быстро и были отчетливо выражены через 1 - 1,5 мин. Увеличивались ам­плитуды пресинаптического компонента ФП - ПД ЛОТ, но особенно постсинаптических - AM ПА и НМДА ВПСП. При этом длительность НМДА-компонента ВПСП существенно воз­растала. Тормозной компонент - ТПСПМ - прогрессивно уг­нетался и, начиная с 5-й минуты, был полностью блокирован (рис. 2, а, б). Наблюдаемые явления, индуцируемые КРФ, были устойчивы и сохранялись в течение 20 мин (время наблюдения) (см. рис. 2, а, б).

Эффекты КРФ были обратимыми, поскольку при отмыва­нии срезов они почти полностью устранялись (см. рис. 2, а, б).

Применение меньшей концентрации КРФ (10-9 М) давало аналогичные эффекты, но менее выраженные. Это свидетельст­вует о дозозависимом характере действия КРФ на электрогенез отдельных компонентов ФП в переживающих срезах обонятель­ной коры мозга крыс.

Следует отметить, что перфузия срезов с КРФ в концентра­ции 5 • 10-8 М приводила в некоторых срезах (л = 3) к повыше­нию спонтанной электрической активности и появлению апе­риодических спонтанно возникающих эпилептогенных разря­дов. Последние часто усиливались при электрической низко­частотной (1/с) стимуляции срезов и выражались в значитель­ном возрастании амплитуды суммарного ВПСП и появлении на нем быстрых высокоамплитудных волн.

Эти данные свидетельствуют о том, что КРФ обладает ней­ротропным свойством и способен длительно модифицировать все базисные электрофизиологические процессы в срезах обо­нятельной коры. Он оказывает, по-видимому, неспецифиче­ские влияния на аксональную возбудимость (увеличение ампли­туды пресинаптического компонента ФП - ПД ЛОТ). Повы­шение активности в волокнах ЛОТ приводит к увеличению ко­личества выделяемого медиатора. Это в свою очередь повышает эффективность деятельности синапса и, очевидно, способствует организации стрессовой реакции организма.

Другими компонентами в формировании стрессовой реак­ции являются изменения постсинаптических процессов при действии КРФ. Эти модификации были наиболее выражены в отношении НМДА-компонента ВПСП и менее - для AM ПА ВПСП. Возрастание амплитуды НМДА-компонента ВПСП свидетельствует об увеличении входящих кальциевых токов, а ее удлинение указывает на увеличение времени открытого состоя­ния этих каналов. Это приводит к повышению возбудимости нервных клеток и способствует формированию стрессовой ре­акции. Такой вывод подтверждается экспериментальными дан­ными об увеличении внутриклеточной концентрации кальция при появлении нейрогормона в экстраклеточной среде [4].

КРФ оказывал также значительное потенцирующее влияние на АМПА-генерируемые процессы. Как известно, их активация сопряжена с усилением входящих натриевых токов, КРФ бла-

6

Рис. 2. Изменения профилей ФП в срезах обонятельной коры мозга крыс при перфузии средой с КРФ в концентрации 10 s М.

а: К - контроль; 1, 2, 3 - ФП через 1, 5, 20 мин от начала перфузии с КРФ; 4 - отмывание среза через 15 мин. Калибровка: 0,1 мВ; 10 мс; б; суммарные данные из­менений амплитуд отдельных компонентов ФП при действии КРФ в концентрации 10“к М. Здесь и на рис. 3: по оси ординат - амплитуда (в % к контролю); по оси абсцисс - время (в мин). К - контроль; ОТ - отмывание через 15 мин (л = 7). / - ПД ЛОТ; // - AM ПА; /// - НМДА.

гоприятствовал этим процессам и также способствовал общему повышению возбудимости нервных клеток.

Что касается тормозных процессов, то они под действием КРФ прогрессивно угнетались и блокировались. Это выража­лось в уменьшении амплитуды ТПСПМ и, следовательно, КРФ действовал на ГАМКБ-рецепторы угнетающим образом и также способствовал повышению возбудимости нервных клеток. Сни­жение тормозящего и увеличение возбуждающего компонента в балансе процессов возбуждения и торможения в нервной сис­теме под действием КРФ сопровождалось в наших эксперимен­тах возникновением эпилептогенных разрядов. Подобные явле­ния также обнаружены in vivo [10, 14] и in vitro на срезах гип­покампа [3]. Полагают, что возникновение судорожных разря­дов опосредуется действием КРФ на КРФ-1-рецепторы.

Представленные данные о действии КРФ как ключевого гормона стресса на электрогенез в переживающих срезах мозга обонятельной коры мозга крыс следует, на наш взгляд, рассмат-

Рис. 3. ДПП, индуцируемая электрической тетанизацией лате­рального обонятельного тракта и аппликацией КРФ (Ю-8 М) в течение 90 мин.

По оси абсцисс: К - контроль, Т и стрелка - тетанизация латерального обонятель­ного тракта и введение КРФ соответственно. / - тетанизация (п = 19); // - КРФ (л = 7).

ривать как электрофизиологическую основу тех процессов, ко­торые разворачиваются в мозге при стрессовых ситуациях. Можно полагать, что КРФ, способствуя формированию стрес­совой реакции организма, может стимулировать развитие неко­торых пластических изменений в ЦНС, тем более что известно модулирующее влияние КРФ на некоторые процессы поведен­ческого обучения и памяти [11]. Кроме того, КРФ активировал ДМ ПА- и НМДА-компоненты ВПСП в наших опытах и вызы­вал повышение уровня внутриклеточного кальция [4].

Для того, чтобы проверить это предположение, срезы мозга перфузировали с КРФ в течение 90 мин. Возбуждающий эффект КРФ проявлялся через 1 - 1,5 мин, достигал своего максимума через 15-20 мин и сохранялся в течение 90 мин (время наблю­дения), причем величина декремента амплитуды НМДА ВПСП составляла к концу наблюдения примерно 20% (рис. 3). Эти данные свидетельствуют о том, что КРФ самостоятельно инду­цировал в клетках срезов мозга явление, аналогичное долговре­менной посттетанической потенциации (ДПП). Ход ее развития несколько отличался от электрически-вызванной ДПП (см. рис. 3). Эти отличия проявлялись в фазе индукции тем, что КРФ-вы- званная ДПП развивалась более медленно, но в фазу сохране­ния была более устойчивой. Это еше раз доказывает, что эндо­генные пептиды принимают активное участие в развитии пла­стических процессов в мозге, способствуя трансформации крат­ковременных базисных процессов возбудимости в длительно сохраняющиеся [1].

Полученные данные раскрывают основные нейрофизиоло­гические механизмы вовлечения возбуждающей (глутаматерги- ческой) и тормозной (ГАМКергической) систем мозга в ответ на действие КРФ, секреция которого при стрессе быстро возрас­тает не только в гипоталамусе, но и во многих структурах мозга. Длительная активация возбуждающих процессов при синхрон­ном подавлении тормозных в нервных клетках, возникновение в них явления устойчивого возбуждения, аналогичного ДПП, индукция спорадических эпилептогенных разрядов - вот те электрофизиологические механизмы, которые, по всей вероят­ности, лежат в основе реакций мозга на разнообразные стрессы.

Выводы