Общепринятым является факт, что секреция инсулина из р-клеток поджелудочной железы, стимулируемая глюкозой и продуктами ее метаболизма, определяется состоянием АТФ-зависи- мых К+-регулируемых каналов [2-4, 6, 7]. Эти каналы обладают свойством блокироваться гипогликемическими сульфаниламидными препаратами, которые используются для лечения диабета II типа (инсулиннезависимого). Каналы представляют собой класс мембранных белков, специализирующихся на высокоскоростном транспорте ионов. В данном случае речь идет о том, что по мере увеличения концентрации глюкозы в плазме одновременно происходит процесс деполяризации клеточной мембраны р-клеток за счет притока Са2+ и его накопления в цитозольной фракции, что и приводит к запуску секреции инсулина. Предполагают, что инсулин- независимый диабет есть результат нарушений работы АТФ-зависимых К+-регулируемых каналов.

Задачей настоящего исследования было оценить состояние К+-АТФ-регулируемых каналов р-клеток поджелудочной железы и охарактеризовать их реакцию в ответ на введение сульфаниламидных препаратов в условиях их частичного поражения под влиянием различных доз стрептозо- тоцина. Эту работу стало возможным провести только с внедрением техники регистрации активности отдельных каналов с помощью метода “пэтч-клампф”, позволяющего точечно фиксировать потенциал на мембране в условиях регистрации от целой клетки [5-11|.

Материалы и методы

Работа проводилась на культивируемых островковых клетках поджелудочной железы самцов беспородных крыс. Выделение и культивирование р-клеток проводилось по ранее описанному методу S. Misler и соавт. |8|. Клетки высевали на 35-миллимегровые пластиковые чашки Петри со средой RPMI и выдерживали минимум 24 ч при 37°С в атмосфере с 5% СО2 в целях прикрепления их ко дну. Перед началом электрофизиологических исследований в культуральную среду добавляли стрептозотоцин в различных концентрациях (1, 2, 5 мМ), растворенный в цитратном буфере. Этот препарат подавали в камеру с помощью локальной микроперфузии. Время воздействия 30 мин. Затем клетки отмывали. В инкубационной среде до и после введения стрептозотоцина определяли концентрацию инсулина, что и было показателем степени поражения р-клеток. Для проведения электрофизиологических измерений культуральную среду меняли на изотонический раствор, который содержал 140 мМ NaCl, I мМ СаС12, 2 мМ MgCl2, 2,8 мМ КС1, 10 мМ HEPES (pH 7,4). Стеклянные микропипетки заполняли изотоническим раствором, имитирующим состав цитоплазмы: 140 мМ КС1, 10 мМ HEPES, 3 мМЕ ОТА. 0,5 мкМ СаС12, 2 мМ MgCl, (pH 7,4). Пипетки имели сопротивление около 5 МОм и были подсоединены к усилителю ЕРС-5 (“List Electronic”, Германия).

В эксперименте использовали только одиночные клетки. Интеграционные токи регистрировали с помощью усилителя, имеющего цепи компенсации емкостных переходных процессов. Ионные токи регистрировали на запоминающем осциллографе и магнитографе. В ходе опыта подсчитывали среднее число каналов, открытых в фиксированной части клеточной мембраны. Анализ кинетических процессов проводили, начиная с момента регистрации, когда был акгивен только один канал [5]. После этого составляли гистограммы, которые отражали суммарный эффект действия того или иного препарата на функционирование отдельно анализируемого ионного канала. Идентификация АТФ-зависимых К+-каналов проводилась с помощью избирательной блокады других Na+- и Са2+-каналов тетродотоксином и хлоридом кадмия соответственно. Все эксперименты проводили при комнатной температуре. Исследуемые сульфаниламидные препараты — гликлазид, глибенкламид и глипизид — добавляли непосредственно во внеклеточный раствор. Всего было проанализировано 87 клеток, потенциал покоя которых в среднем составлял 61,2 ± 2 мВ.

Результаты и их обсуждение

Электрофизиологическая оценка состояния АТФ-чувствительных К+ -каналов fl-клеток, функционально ослабленных под влиянием стрептозц- тоцина. В первой серии исследований нами была проведена идентификация К+-АТФ-чувствитель- ных каналов к глюкозе в фиксированных мембранах клеток. Каналы интактных клеток характеризовались устойчивой величиной потенциала покоя, который находился в пределах 60-62 мВ. Популяция этих каналов закрывалась через 2- 5 мин после начала перфузии клеток раствором, содержащим 5-10 мМ глюкозы. Закрытие каналов сопровождалось началом спайковой активности клеток, открывались же они вновь через 2- 5 мин после отмывания глюкозы, и это повторное открытие совпадало с исчезновением спайковой активности. Каналы не проявляли больших вариаций по величине потенциала покоя и . максимальная их величина была в пределах + 100 мВ.

Аналогичные исследования, проведенные на клетках, предварительно перфузируемых различными дозами стрептозотоцина, показали сниженную их функциональную активность. Электрофизиологически это выражалось в снижении величины потенциала покоя на 10-25 мВ в зависимости от степени поражения. Наиболее демонстративными были изменения исследованных

Влияние глюкозы, глибенкламида, гликлазида и глипизида на некоторые электрофизиологические показатели К+-АТФ-зависимых каналов интактных (I) и функционально ослабленных (II) под воздействием стрептозотоцина (2 мМ) р-клеток

Средняя продолжительность

нами показателей после перфузии 2 мМ стрептозотоцина. Период закрытия каналов после воздействия на эти клетки раствора, содержащего 5- 10 мМ глюкозы, задерживался и составлял 5- 7 мин (контроль 2-5 мин). Это приводило к увеличению латентного периода возникновения спайковой активности. Аналогичную картину наблюдали и после отмывания глюкозы: необходимо было 6-7 мин, чтобы вновь произошло открытие каналов и исчезла спайковая активность.

Функциональная оценка состояния АТФ-чувствительных К*-каналов ft-клеток, частично пораженных под воздействием сульфонилмочевинных препаратов. В таблице представлены полученные нами результаты исследований по анализу ряда электрофизиологических показателей состояния К+-АТФ-зависимых каналов интактных и функционально ослабленных р-клеток после аппликации глюкозы, глибенкламида, гликлазида и глипизида. Наиболее типичной реакцией исследуемых каналов в этих экспериментальных условиях было их полное закрытие под влиянием испытуемых препаратов. Однако в отличие от интактных клеток, когда концентрация применяемых препаратов для достижения эффекта колебалась от 1 до 20 мМ, для функционально ослабленных р-клеток необходимы были дозировки, превышающие вышеуказанные в 2,5-3 раза. Процесс закрытия канала наступает значительно медленнее, чем в норме, достигает устойчивого состояния в течение 40-50 с и длится до 14-15 мин. Отмывание клеток приводит к восстановлению активности этих каналов до исходного уровня, хотя этот процесс идет также весьма инерционно.

Сравнительный анализ действия тестируемых сульфонилмочевинных препаратов на функционально ослабленные клетки, как и в случае с интактными клетками, показал, что глибенкла- мид является наиболее активным препаратом по способности стимулировать секрецию инсулина. Это наглядно проявлялось в более быстрых темпах закрытия каналов и начале возникновения спайковой активности по сравнению с действием гликлазида и глипизида. Блокада же АТФ-зависимых К+-каналов, приводя к деполяризации клеточной мембраны и возникновению потенциала действия, способствует вхождению ионов кальция внутрь клетки и совместно со свообод- ным кальцием в цитозоле достигает необходимого уровня для активации экзоцитоза секреторных гранул инсулина.

В своих предыдущих исследованиях 111 на интактных р-клетках нами было показано, что анализируемые препараты оказывают специфическое действие на характер биоэлектрической активности АТФ-зависимых К+-каналов, точнее, на временной характер ее распределения. Как правило, активность анализируемых каналов проявляется пачковыми разрядами стандартной амплитуды, чередующимися с паузами длительностью несколько секунд. Структура биоэлектрической активности АТФ-зависимых К+-кана- лов р-клеток со сниженной активностью практически не менялась. Добавление любого из исследуемых препаратов вызывало сокращение длительности разрядов с одновременным увеличением интервала между пачками, такой же эффект наблюдался и после добавления глюкозы.

Детальный анализ динамики протекающих в ионном канале процессов, таких, как средняя продолжительность разрядов, время открытия канала, средняя продолжительность закрытия канала в пачковом разряде, средняя продолжительность интервала в разряде, как наиболее типичных и информативных показателей при оценке действия сульфаниламидных препаратов продемонстрировал, что все анализируемые показатели снижены по абсолютной величине, что свидетельствует о снижении функциональной активности каналов в наших экспериментальных условиях. Так, обработка р-клеток стрепозотоци- ном в дозе 2 мМ приводила к снижению средней продолжительности разряда на 14% от исходной, а интервал между пачками уменьшался на 29%. Продолжительность времени открытия снижалась на 5%, а средняя продолжительность интервала в разряде — на 25%. Эти данные свидетельствуют о том, что р-клетки в наших экспериментальных условиях сохраняют свою функциональную активность. Об этом также свидетельствуют данные ответной реакции пораженных р-клсток на введение глюкозы. Например, добавление 3,2 мМ глюкозы сокращает время открытия канала на 9% от исходного, средняя продолжительность интервала в разряде уменьшается на 8%. Средняя продолжительность разряда сокращалась в 3 раза, а интервал между пачками увеличивался в 8 раз. Все это свидетельствует в пользу специфической ответной реакции функционально ослабленных р-клеток на введение глюкозы, наиболее четко проявляющейся в сниженной способности каналов к открытию за счет сокращения длительности разрядов и увеличения продолжительности интервала между ними.

Аналогичные результаты были получены нами в опытах с аппликацией сульфаниламидных препаратов. Применение К) мМ глибенкламида на р-клетки, частично пораженные стрептозотоци- ном. вызывало снижение вероятности открытия канала на 25-27%, время открытия уменьшалось на 13-14%, средняя продолжительность разряда сокращалась в 3,5 раза, продолжительность межимпульсных интервалов увеличивалась в 25 раз. Подобные результаты были отмечены нами и при применении гликлазида и глипизида.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что АТФ-зависимые К+-каналы р-клеток, подвергнутых воздействию стрептозотоцина, сохраняют в основном свои функциональные свойства и способны адекватно реагировать на специфические раздражители, какими являются глюкоза и сульфаниламидные препараты. Следует обратить внимание на факт более медленного закрытия АТФ-зависимых К+-каналов и удлинения тем самым латентного периода секреции инсулина, начиная от момента воздействия глюкозы или сульфонилмочевинных препаратов до момента экзоцитоза кванта инсулина. Процесс приобретает более инерционный характер. В этом случае нельзя исключить нарушения внутриклеточного метаболизма р-клеток, способного привести и к нарушениям их структуры. Хорошо известно, что добавление АТФ в культуру клеток очень быстро приводит к восстановлению активности К+-АТФ-чувствительных каналов, которые являются стратегически важной точкой в реализации эффекта сульфонилмочевинных препаратов в цепи стимул — секреция. Эти каналы являются ответственными за проявление прямого фармакологического действия на процессы электрогенеза, приводящие к секреции инсулина р- клетками. Весьма серьезным фактом, отмеченным нами, является то, что как глюкоза, так и сульфаниламидные препараты оказывают обратимое влияние на функционирование каналов. Наблюдавшиеся нами эффекты восстанавливались после отмывания препарата.

Вопрос, поставленный нами в изучении особенностей функционирования ионных каналов в Р-клетках, частично ослабленных под влиянием стрептозотоцина, весьма актуален для специ- алистов-диабетологов при выборе препарата для терапии конкретного больного диабетом II типа.

Выводы