Согласно популярной в последнее время гемо динамической концепции развития диабетической нефропатии (ДН), на ранних стадиях становления патологии важную роль играет внутриклубочковая гипертензия, возникающая в результате усиления контролируемого вазодилататорами притока крови в почечный клубочек на фоне уменьшения ее от тока через выносящую артериолу [1]. Окись азота (NO), ранее описанная как эндотелиальный фак тор релаксации [17], играет важную роль в регуля ции тонуса кровеносных сосудов (вазодилатация), работы гладких мышц сосудистой стенки и тром- богенеза. NO вырабатывается из L-аргинина при участии фермента NO-синтазы. Известны 3 формы данного фермента, кодируемые разными генами. Эндотелиальная NO-синтаза является продуктом гена NOS3, расположенного на хромосоме 7q36 [14]. Этот ген по праву можно рассматривать в чис ле кандидатов на связь с ДН. Ген NOS3 состоит из 26 экзонов. В экзонах и ин тронах обнаружен ряд полиморфных участков, из которых в настоящем исследовании изучено 2: ми- Таблица 1 Общая характеристика обследованных групп больных диабетом типа 1 с наличием и отсутствием ДН Показатель (средний ± S. D.) ДН+ (л = 36) ДН- (л = 56) Пол, м/ж 17 /19 26 /30 Возраст, годы 22,3 ± 4,5 37,9 ± 9,4 Возраст начала диабета типа 1, годы 10,1 ± 4,3 10,4 ± 5,4 Длительность диабета типа 1, годы 12,2 + 2,1 27,5 + 7,2 Уровень НЬ А,, % 11,8 ± 2,2 11.2 ± 2,6 Скорость экскреции белка, мг/сут 1371 + 1115 26,1 ± 14,8 Систолическое давление, мм рт. ст. 130,5 ± 21,5 121,3 + 14,4 Диастолическое давление, мм рт. ст. 87,4 ± 17,2 75,7 ± 8,7 Примечание. S. D. - стандартное отклонение, нисателлит в интроне 4 (ecNOS4a/4b) [16] и мис- сенс-мутация в кодоне 298, ведущая к замене глута мата на аспартат (Glu298Asp) [27]. Молекулярный вариант NO-синтазы, несущий аспарагиновую ки слоту в 398-м положении, сцеплен с повышенным риском развития таких сосудистых патологий, как гипертония [8, 13, 26], инфаркт миокарда [16, 19] и ишемическая цереброваскулярная болезнь [5]. Минисателлит ecNOS4b/4a насчитывает 2 алле ля, состоящих из 4 (аллель 4а) или 5 (аллель 4Ь) тандемных повторов размером 27 пар нуклеотидов (п. н.) [23]. В популяции аллель 4Ь встречается зна чительно чаще, чем аллель с 4 повторами. У лиц, гомозиготных по редкому аллелю, повышен уро вень нитратов и нитритов в крови, напрямую свя занный со скоростью выработки NO эндотелием сосудов, что свидетельствует о потенциальной ге нетической роли генотипа 4а/4Ь как фактора риска развития атеросклероза и заболеваний, приводящих к нарушению нормальной выработки NO [21, 24]. Действительно, генетические исследования по казали связь полиморфного участка с гипертонией [22], инфарктом миокарда [10, 23], коронарным ате росклерозом [8], венозным тромбозом и поражени ем сосудов мозга [4]. Четко прослеживается связь между уровнем продукции NO в организме и выра женностью окислительного стресса при сосудистых патологиях, выражающаяся в ингибировании синте за и резком снижении содержания NO в кровяном русле при накоплении свободных радикалов кисло рода и перекисей. Последний факт подтверждается наблюдениями в японской популяции, выявивши ми достоверно более низкое содержание внеклеточ ной супероксиддисмутазы (одного из главных фер ментов антиоксидантной защиты) у гомозиготных носителей аллеля 4а гена NOS3 по сравнению с дру гими вариантами генотипов [3]. Окислительный стресс является общепризнан ным фактором, усиливающим риск развития сер дечно-сосудистых патологий. При диабетической гипергликемии пагубное влияние избытка свобод ных радикалов кислорода на сосуды еще более воз растает. Происходит неферментативное гликозили рование белков, сопряженное с окислением глюко зы, липидов и самих гликозилированных белков [12, 18]. Поэтому гены антиоксидантной защиты, про дукты которых разлагают высокореактивные кисло родные соединения с неспаренным электроном и перекиси, также могут быть потенциально связаны с развитием диабетических ангиопатий, к которым относится ДН. Одним из таких генов является ген SOD2, кодирующий митохондриальную Мп-зависи- мую супероксиддисмутазу. Последняя катализирует реакцию дисмутации супероксид-ион-радикала (по бочного продукта окислительного фосфорилирова ния) с образованием воды и перекиси водорода, ко торая затем разлагается каталазой до свободного ки слорода и воды. Ген SOD2 расположен на хромосо ме 6q25.3 [6]. Рядом с ним локализован высокопо лиморфный микросателлит D6S392, состоящий из тандемно повторяющихся копий вырожденного мо тива GAAA [9]. Данный локус наряду с двумя выше упомянутыми вариабельными участками гена NOS3 мы использовали в ассоциативном исследовании ге нетической предрасположенности к ДН при диабете типа 1. Материалы и методы Анализ полиморфизма вариабельных локусов проводили на геномной ДНК, выделенной из цель ной крови 92 больных диабетом типа 1 с наличием (и = 36) и отсутствием (и = 56) ДН. Группы обсле дованных формировали по принципу неперекры- вающихся ("полярных") фенотипов из числа паци ентов Эндокринологического научного центра РАМН. В группу ДН+ вошли больные с длитель ностью диабета не более 15 лет и клинической про теинурией (альбуминурия свыше 300 мг/сут). Груп пу ДН- составили пациенты с альбуминурией ме нее 200 мг/сут, болеющие диабетом типа 1 на про тяжении 20 лет и более (табл. 1). ДНК из крови выделяли методом экстракции с фенолом и хлороформом после предварительной инкубации с протеиназой К ("Merck", Германия) [11 ]. Полиморфные участки амплифицировали с по мощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Ам плификацию фрагмента гена NOS3 с вариабельным участком Glu298Asp проводили в 50 мкл реакцион ной смеси, содержащей 67 мМ трис-НС1 pH 8,8, 16,7 мМ сульфат аммония, 1,5 мМ хлорид магния, по 0,2 мМ каждого dNTP, 0,1% твин-20, 10% диметилсуль фоксид, по 5 пмолей каждого праймеров NOS3- VNTR1 (5'-AGGCCCTATGGTAGTGCCTTT-3') и NOS3-VNTR2 (5'-TCTCTTAGTGCTGTGGTCAT- 3'), 50-100 нг геномной ДНК человека и 2 ед. Taq- полимеразы ("Fermantas", Литва). Аллели микроса теллита ecNOS4a/4b амплифицировали в смеси того же состава, но использовали 1,0 мМ хлорид магния и праймеры NOS298L (5'-AAGGCAGGAGACAGT- GGATGGA-3’) и NOS298R (5'-CCCAGTCAATC- CCTTTGGTGCTCA-3’). Амплификацию локуса D6S392 проводили в присутствии 1,0 мМ хлорида магния и праймеров D6S392F (5'-AGAGGAAG- GGAAATCATGC-3’) и D6S392R (5'-GTATACT- CAGTTCGTTCGTTT-3'). ПЦР проводили на тер моциклере РНС-2 фирмы "Techne" (Великобрита ния) по следующей программе: первый цикл - 94°С/3 мин, следующие 35 циклов - 94°С/1 мин, 55°С (Glu298Asp и D6S366) или 60°С (ecNOS4a/4b)/ 1 мин, 72°С/1 мин, последний цикл - 72°С/6 мин. Аллели полиморфного участка ecNOS4b/4a идентифицировали, электрофоретически разделяя продукты ПЦР в 2% агарозном геле с последующей окраской бромидом этидия. Амплифицированные аллели локуса D6S366 разделяли в 12% полиакрил амидном геле, который затем окрашивали сереб ром [5]. В случае мутации Glu298Asp продукты ПЦР расщепляли рестриктазой Mbol ("Fermantas", Литва). К 15 мкл продуктов ПЦР добавляли 2 мкл 10-кратного буфера Y (10 мМ трис-НС1 pH 8,5, 10 мМ хлорид магния, 100 мМ КС1), 2 мкл БСА (1 мг/мл) и 1 мкл рестриктазы (5 ед.), смесь инку бировали в течение 3 ч при 37°С. Продукты расще пления разделяли в 2% агарозном геле. Частоты аллелей и генотипов в группах ДН+ и ДН- сравнивали с помощью точного критерия Фишера, считая достоверными различия при р > 0,05. Относительный риск (ДА) расчитывали, как описано ранее [20], рассматривая значения RR > 1 как фактор риска развития изучаемой пато логии, a RR < 1 как предохраняющий фактор. Результаты и их обсуждение В московской популяции выявлен 31 аллель тет- рануклеотидного микросателлита D6S392 размером от210до 330 п. н. В обеих группах больных диабетом обнаружено 27 аллелей (табл. 2). С наибольшим рис ком развития ДН связан аллель длиной 238 п. н. (RR = 7,41), тогда как аллель длиной 298 п. н., на оборот сцеплен с минимальным риском данной па тологии (RR = 0,38). Однако ввиду того, что частоты этих аллелей в группах ДН- и ДН+ различались не достоверно, не имеет смысла считать их генетиче скими маркерами предрасположенности либо ус тойчивости к ДН. Таким образом, локус D6S392 ря дом с геном SOD2 не связан с ДН в московской по пуляции. Однако эти результаты являются предва рительными ввиду недостаточного числа обследо ванных при использовании столь высокополиморф ного маркера, каким является локус D6S392. Для уточнения полученных данных требуется сущест венно увеличить имеющиеся выборки больных. Конечно, для повышения точности и информа тивности генетического анализа было бы интересно использовать какой-либо полиморфный локус внут ри самого гена SOD2. К сожалению, в этом гене к на стоящему времени не описано никаких методически удобных и информативных полиморфных маркеров. Таблица 2 Сравнительный анализ распределения частот (в %) аллелей ло куса D6S392 у больных с наличием и отсутствием ДН Длина аллеля. Частота RR п. н. ДН+ (п = 36) ДН- (л = 56) 210 0 0 1,44 214 0 0 1,44 218 0 1,0 0,48 222 1,4 0 4,39 226 0 0 1,44 230 0 0 1,44 234 1,4 1,0 1.45 238 2,8 0 7,41 242 4,2 1,9 2,07 246 4,2 4,8 0,91 250 1,4 1,9 0,86 254 4,2 5,8 0,76 258 6,9 4,8 1,47 262 5,6 5,8 0,99 266 6,9 5,8 1,24 270 8,3 2,9 2,84 274 4,2 3,8 1,13 278 5,6 4,8 1,19 282 5,6 6,7 0,85 286 5,6 3,8 1,47 290 4,2 10,6 0,41 294 5,6 3,8 1,47 298 1,4 4,8 0,38 302 2,8 4,8 0,64 306 2,8 2,9 1,03 310 2,8 5,8 0,54 314 2,8 3,8 0,79 318 4,2 3,8 1,13 322 4,2 3,8 1,13 326 0 1,0 0,48 330 1,4 0 4,39 Примечание. Здесь и в табл. 3 различия между группами достоверны при р > 0,05. Таблица 3 Распределение аллелей и генотипов (в %) полиморфного участка Glu298Asp гена NOS3 в группах больных диабетом типа 1 с на личием и отсутствием ДН Генетический маркер Группа ДН+ (п = 36) Группа ДН- (я = 56) RR Аллель Glu 81,9 79,5 1,15 Аллель Asp 18,1 20,5 0,86 Генотип Glu/Glu 66,7 62,5 1,19 Генотип Glu/Asp 30,5 33,9 0,87 Генотип Asp/Asp 2,8 3,6 0,92 Правда, недавно удалось обнаружить точечную мута цию в нуклеотиде 18 (замена гуанидина на тимидин), однако ее полиморфизм пока не изучен [7]. В результате амплификации полиморфного уча стка Glu298Asp гена NOS3 образуется фрагмент ДНК длиной 248 п. н. В случае аллеля Glu он со держит измененный участок узнавания рестрикта- зы Mbol и не расщепляется данным ферментом. Аллель Asp, напротив, расщепляется рестриктазой на 2 фрагмента размером 90 и 158 п. н. Таким об разом, наличие после обработки Mbol нерасщеп- ленного продукта ПЦР (248 п. н.) соответствует ге нотипу Glu/Glu, присутствие двух фрагментов (90 и 158 п. н.) - гомозиготе Asp/Asp, трех фрагментов длиной 90, 158 и 248 п. н. - гетерозиготе Glu/Asp. Анализ полиморфизма вариабельного участка Glu298Asp в группе ДН- выявил существенное преобладание аллеля Glu298, частота встречаемо сти которого почти в 4 раза превышала долю аллеля Asp298 (табл. 3). Как следствие в этой группе наи более широко представлен гомозиготный генотип Glu/Glu (62,5%). Гомозиготы Asp/Asp встречались крайне редко: данный генотип обнаружен лишь у 2 из 56 пациентов. Распределение аллелей и геноти пов у больных нефропатией носило тот же харак тер, что и в группе ДН~. Ввиду очевидной близости характеров распределения аллелей и генотипов ге на NOS3 в обеих группах больных сравнительный анализ по Фишеру не выявил каких-либо достовер ных различий в частотах встречаемости как алле лей, так и генотипов. Таким образом, в московской популяции полиморфный участок Glu298Asp гена NOS3 не связан с ДН на фоне диабета типа 1. При амплификации минисателлита ecNOS4a/4b происходит синтез двух фрагментов разной длины - аллеля 4а (393 п. н.) и аллеля 4Ь размером 420 п. н. В обеих группах больных, как и ожидалось, содер жание аллеля 4Ь значительно превышало долю ал леля 4а (табл. 4). У больных нефропатией наиболее распространены гетерозиготы 4а/4Ь, а у пациентов без ДН, напротив, преобладал гомозиготный вари ант 4Ь/4Ь. Генотип 4а/4а встречался в обеих груп пах крайне редко. По сравнению с контрольной группой у паци ентов с ДН более, чем в 1,74 раза, повышено со- Таблица 4 Распределение аллелей и генотипов (в %) минисателлита ccNOS4b/4a гена NOS3 в группах больных диабетом типа 1 с на личием и отсутствием ДН Генетический маркер Группа ДН+ (л = 36) Группа ДН- (л = 56) Р RR Аллель 4а 38,9 22,3 0,01246 2,20 Аллель 4Ь 61,1 77,7 0,01246 0,46 Генотип 4а/4а 8,3 1,8 >0,05 3,86 Генотип 4а/4Ь 61,1 41,1 0,04791 2,21 Генотип 4Ь/4Ь 30,6 57,1 0,01085 0,34 держание аллеля 4а на фоне соответствующего уменьшения доли аллеля 4Ь, и эти различия досто верны (см. табл. 4). В группе ДН+ частота встре чаемости генотипа 4Ь/4Ь в 1,87 раза меньше, чем в группе ДН-. Содержание гетерозигот 4а/4Ь и го мозигот 4а/4а, напротив, увеличено соответствен но в 1,49 и 4,61 раза. Различия в распределении ге нотипов 4а/4Ь и 4Ь/4Ь носят достоверный характер (см. табл. 4). Следовательно, полиморфный маркер ecNOS4a/4b гена NOS3 ассоциирован с ДН при диабете типа 1 в московской популяции. Наличие аллеля 4а (АА = 2,20) и особенно генотипа 4а/4а (RR = 3,86) увеличивает риск развития данной па тологии, тогда как гомозиготное носительство ал леля 4Ь, наоборот, ослабляет его (RR = 0,34). К сожалению, пока нет данных о результатах ге нетического анализа в зарубежных популяциях роли эндотелиальной NO-синтазы в патогенезе ДН. Про веденное недавно в Великобритании исследование не показало сцепления между высокополиморфным ди- нуклеотидным микросателлитом в интроне 13 гена NOS3 и другой диабетической микроангиопатией - пролиферативной ретинопатией при диабете обоих типов [25]. Ранее мы обнаружили строгую ассоциа цию между геном ангиотензин 1-превращающего фермента и ДН при диабете типа 1. Ангиотензин I- превращающий фермент играет ключевую роль в синтезе ангиотензина II - важнейшего вазоконст риктора, оказывающего влияние на макро- и микро сосуды всех органов и тканей, включая почки. Полу ченные нами данные свидетельствуют о важной роли в патогенезе ДН генов, продукты которых тесно свя заны с метаболизмом таких вазоактивных агентов противоположного друг к другу действия на сосуды, какими являются NO и ангиотензин II. Таким обра зом, наши результаты подтверждают справедливость гемодинамической концепции патогенеза ДН. Выводы 1. Показано отсутствие связи между полиморф- ным-микросателлитом 6S392 рядом с геном SOD2 и ДН при диабете типа 1. 2. Не обнаружено ассоциации между полимор физмом Glu298Asp гена NOS3 и ДН на фоне диа бета типа 1. 3. Другой полиморфный маркер гена NOS3 - минисателлит ecNOS4a/4b - напротив, связан с заболеванием. При этом аллель 4а и генотип 4а/4а выступают в качестве генетических маркеров рис ка, в то время как носительство аллеля 4Ь и гено типа 4Ь/4Ь снижает риск развития патологии.