С целью исследования особенностей взаимосвязи между уровнями активности неспецифической эстеразы (НЭ) и α-глицерофосфатдегидрогеназы (α-ГФДГ) лимфоцитов и концентрации тиреотропного, тиреоидных гормонов и кортизола в крови у женщин с аутоиммунным тиреоидитом (АИТ) обследовано 37 больных с впервые выявленным АИТ(в фазе эутиреоза) и 15 практически здоровых женщин. Оценку активности α-ГФДГ и НЭ осуществляли с помощью метода компьютерной морфо- денситометрии. Обнаружено, что в лимфоцитах крови больных А И Т повышается активность α-ГФДГ, что проявляется в виде повышения оптической плотности гранул. Вместе с тем, поскольку при этом отсутствует повышение площади гранул диформазана, можно сделать заключение о том, что активность фермента увеличивается при отсутствии выраженного синтеза и повышения функциональной активности митохондрий. Морфоденситометрический анализ также позволил обнаружить увеличение активности НЭ, что отражает повышение деструктивных реакций в иммунокомпетентных клетках при исследуемом аутоиммунном процессе.
Thirty-seven female patients with first diagnosed autoimmune thyroiditis (AIT) in the eurothyrosis phase and 15 healthy women were examined to establish a relationship between the activities of lym phocytic nonspecific esterase (NE) and α-glycerophospate dehydro genase (α-GPDH) and blood concentrations of thyrotropic, thyroid hormones, and hydrocortisone. The activities of α-GPDH and NE were evaluated by computer morphodensitometry. The activity of α- GPDH was higher in the lymphocytes of AIT patients, as man ifested by an increase in the optical density of granules. But this was not parallel by a rise in the area of diformasane granules, and therefore it is concluded that the enzymatic activity was increased without a pronounced synthesis and an increase in mitochondrial functional activity. Moreover, a morphodensitometric analysis showed higher NE activity, reflecting enhanced destructive reactions in the immu nocompetent cells in AIT.
Аутоиммунный тиреоидит (АИТ) - широко распространенная патология щитовидной железы, при которой нарушения в иммунной системе явля ются и этиологическим фактором, и обусловлива ют основные патогенетические процессы [3, 13]. Иммунокомпетентные клетки, синтезируя биоло гически активные вещества, а также через аутоим мунные реакции, оказывают значимое влияние на гомеостаз организма. В то же время богатый набор рецепторов делает их высокочувствительными к разнообразным изменениям во внутренней среде организма [
Целью исследования явилось изучение взаимо связей между уровнями активности неспецифиче ской эстеразы (НЭ) и а-глицерофосфатдегидроге- назы (а-ГФДГ) лимфоцитов и концентрацией ти реотропина, тиреоидных гормонов и кортизола в крови у лиц с АИТ.
Выбор данных метаболических параметров обу словлен тем, что представленные ферменты опре деляют функциональную возможность иммуно компетентных клеток, а синтез а-ГФДГ в клетках регулируется тиреоидными гормонами [9, 11].
Материалы и методы
Обследованы женщины в возрасте 20-50 лет: 37 больных с впервые выявленным АИТ в состоянии эутиреоза и 15 практически здоровых женщин. Ди агноз АИТ ставили на основании клинических данных, результатов ультрасонографии щитовид ной железы и по оценке титра антител к тиреоид ной пероксидазе. Проводили цитологический ана лиз биопсийного материала щитовидной железы и радиоиммунный анализ концентрации тиреотроп ного гормона (ТТГ), тиреоидных гормонов (Т3, Т4 и FT4) и кортизола.
Цитохимическое окрашивание лимфоцитов пе риферической крови на а-ГФДГ осуществляли по методу Р. П. Нарциссова [
Для всех полученных данных определяли сред нее арифметической значение (X) и ошибку сред ней арифметической (т). Проверку гипотезы о ста тистической достоверности отличий двух выборок проводили с помощью критерия Манна-Уитни. Уровни взаимосвязи между активностью внутри клеточных ферментов и концентрацией гормонов оценивали с помощью корреляционного анализа.
Результаты и их обсуждение
Морфоденситометрические параметры а-ГФДГ лимфоцитов крови здоровых людей и больных АИТ представлены в табл. 1. Обнаружено, что у больных женщин в лимфоцитах крови значительно возрастает оптическая плотность гранул диформа- зана, образованного в ходе ферментативной реак ции а-ГФДГ. Исследуемый фермент локализуется строго в митохондриальном компартменте и явля ется компонентом а-глицерофосфатного водород ного шунта, регулирующего соотношение НАДН/ НАД+ в цитоплазме и митохондриях [
До сих пор обсуждается возможность использо вания ферментативной реакции с а-нафтилбутира- том (НЭ) для дифференциации морфологических вариантов лимфоцитов [6, 8, 11]. Предполагается, что лимфоциты с отрицательной реакцией на НЭ являются В-лимфоцитами, лимфоциты с локаль ным распределением активности НЭ (в виде 1-2 крупных гранул) - Т-хелперами, а клетки с диф фузным распределением активности фермента - оставшимися субпопуляциями Т-клеточной систе мы (см. рисунок). Нами обнаружено, что у паци ентов с АИТ достоверно повышено относительное содержание лимфоцитов с локальным распределе нием активности НЭ (10,83 ± 2,69% у здоровых, 25,58 ± 3,55% у больных АИТ; р < 0,05), но сниже на концентрация иммунокомпетентных клеток с
Таблица 1
Морфоденситометрические параметры активности а-ГФДГ в лимфоцитах крови здоровых людей и больных АИТ (X ± т)
Показатель | Здоровые (п - 15) | АИТ (л = 37) | Р |
S, пиксель2 | 295,37 ± 89,77 | 253,42 ± 33,95 | |
Р, пиксель | 65,86 ± 13,94 | 94,86 ± 15,22 | - |
FF, о. е. | 0,94 ± 0,01 | 0,88 ± 0,01 | - |
OD, е. о. п. | 8,12 ± 0,98 | 14,82 ± 0,70 | < 0,01 |
Rx, пиксель | 15,43 ± 5,70 | 16,74 ± 1,69 | - |
Ry, пиксель | 12,48 ± 4,48 | 16,68 ± 1,82 | - |
IOD, (пиксель-е. о. п.) 982,23 ± 211,67 1278,04 ± 161,38 -
а
Лимфоциты с локальным (а) и диффузным (б) распределением активности НЭ.
отрицательной реакцией на НЭ (здоровые - 51,27 ± 3,47%, АИТ - 23,74 ± 3,90%; р < 0,01).
При данной патологии изменяются и морфо денситометрические параметры НЭ в лимфоцитах крови (табл. 2), причем все выявленные изменения в морфоденситометрических параметрах НЭ лим фоцитов крови женщин с АИТ по сравнению со здоровыми однозначно отражают выраженную ак тивацию фермента. Так, в лимфоцитах с диффуз ным распределением НЭ выявляется увеличение площади, периметра, оптической плотности и как следствие интегральной оптической плотности НЭ. Снижение фактора формы при АИТ опреде ляется большим количеством раздельных гранул, в то время как в лимфоцитах здоровых женщин чаще встречаются конгломераты гранул. По этой же причину в лимфоцитах больных АИТ повышено усредненное расстояние между гранулами. Грану лы, представляющие собой продукт ферментатив ной реакции НЭ в иммуноцитах лиц с АИТ, рас пределены по всей клетке.
Выявлены различия в величинах морфоденсито метрических параметров НЭ в лимфоцитах с ло кальным распределением активности. В данной популяции клеток у пациентов с АИТ обнаружено увеличение площади, периметра, оптической плот ности и интегральной оптической плотности цито химических гранул.
При исследовании связей между уровнями ис следуемых гормонов и величинами морфоденсито метрических показателей активности а-ГФДГ и НЭ в лимфоцитах крови обнаружено различие взаимоотношений в системе корреляционных свя зей здоровых женщин и больных АИТ. У здоровых женщин выявляется положительная взаимосвязь Т4 и FT4 с усредненным расстоянием между гранула ми диффузно распределенной НЭ в лимфоцитах крови (г = 0,50; 0,1 > р > 0,05 и г = 0,78; р < 0,05 соответственно). Также обнаружены положитель ные корреляционные связи FT4 с площадью, пери метром и интегральной оптической плотностью гранул диффузно распределенной НЭ (г = 0,80, р < 0,01; г = 0,80, р < 0,01 и г = 0,59, р < 0,05 соот ветственно). Для этой же группы установлены от рицательные взаимосвязи ТТГ с оптической плот ностью локально и диффузно распределенных гра нул НЭ в клетках (г = -59 и г = -0,63; р < 0,05 со ответственно), а также положительные корреляци онные связи ТТГ с усредненным расстоянием ме ждулокально и диффузно распределенными грану лами НЭ (г = 0,63 и г = 0,56; р < 0,05 соответствен но). Можно сделать заключение о том, что тирео идные гормоны в целом активируют НЭ, причем увеличение активности НЭ сопровождается рас пределением гранул по всей лимфоидной клетке. В связи с этим не удивительно, что выявляется отри цательная взаимосвязь концентрации ТТГ с актив ностью НЭ в лимфоцитах крови.
Таблица 2
Морфоденситометрические параметры НЭ в лимфоцитах крови
здоровых людей и больных АИТ (X ± т) | |||
Показатель | Здоровые (л= 15) | АИТ (и = 37) | Р |
В лимфоцитах с диффузным распределением активности | |||
S, пиксель2 | 47,84 ± 7,02 | 102,89 ± 10,53 | < 0,01 |
Р, пиксель | 23,47 ± 2,58 | 44,95 ± 3,78 | < 0,01 |
FF, о. е. | 0,96 ± 0,01 | 0,93 ± 0,01 | < 0,05 |
OD, е. о. п. | 10,18 ± 0,83 | 12,69 ± 0,48 | < 0,01 |
Rx, пиксель | 0,37 ± 0,26 | 14,29 ± 1,66 | < 0,001 |
Ry, пиксель | 0,01 ± 0,001 | 12,02 ± 1,56 | < 0,001 |
IOD, пиксель • е. о. п | 299,34 ± 48,75 | 686,88 ± 53,72 | < 0,001 |
В лимфоцитах с локальным распределением активности
S, пиксель2 | 74,42 ±20,16 | 294,95 ±41,60 | < 0,01 |
Р, пиксель | 23,00 ± 3,38 | 105,45 ± 14,88 | < 0,001 |
FF, о. с. | 0,95 ± 0,02 | 0,86 ± 0,02 | < 0,05 |
OD, е. о. п. | 13,45 ± 0,68 | 16,31 ± 0,44 | < 0,01 |
Rx, пиксель | 7,42 ± 3,44 | 13,16 ± 1,71 | |
Ry, пиксель | 9,11 ± 3,69 | 13,87 ± 1,83 | |
1OD, пиксель-е. о. п. | 712,48 ± 127,06 | 2207,69 ± 222,03 | < 0,01 |
У больных АИТ обнаружены отрицательные связи между концентрацией Т3, Т4 и показателями усредненных расстояний между диффузно распре деленными гранулами НЭ в лимфоцитах (г= -0,31 и г= -0,31; 0,1 > р> 0,05 соответственно). Кроме того, у лиц данной группы выявляется также поло жительная корреляция между Т4 и оптической плотностью диффузно распределенной НЭ в клет ках (г = 0,33; 0,1 > р > 0,05). В целом можно отме тить, что взаимосвязи между тиреоидными гормо нами и активностью НЭ в лимфоцитах крови у больных АИТ ослабевают. Однако, как и у здоро вых лиц, у больных АИТ проявляется тенденция к активирующему действию тиреоидных гормонов на уровень НЭ в иммунокомпетентных клетках. В лимфоцитах здоровых лиц повышение концентра ции тиреоидных гормонов сопровождается более диффузным распределением гранул по клетке, в то время как у больных с АИТ гранулы располагаются конгломератами. Достоверных связей между кон центрацией ТТГ в сыворотке и морфоденситомет- рическими параметрами НЭ в лимфоцитах боль ных АИТ не найдено.
Характер обнаруженных взаимосвязей между концентрациями тиреоидных гормонов и морфо- денситометрическими показателями а-ГФДГ в лимфоцитах здоровых и больных лиц противопо ложен. Так, в группе здоровых установлены поло жительные корреляционные связи содержания Т3 и FT4 с усредненным расстоянием между гранулами а-ГФДГ (г = 0,84 и г - 0,59; р < 0,05 соответствен но), а также между концентрацией Т4 и площадью гранул (г = 0,81; р < 0,05). Кроме того, в данной группе обследуемых обнаружена отрицательная взаимосвязь между концентрацией ТТГ и оптиче ской плотностью гранул диформазана (/-=-0,91; р < 0,05), образованного в результате реакции а-ГФДГ. В то же время у женщин с АИТ выявлены отрица тельные взаимосвязи площади гранул диформазана с уровнем Т3, Т4 и FT4 в сыворотке (г = -0,34, 0,1 >/>>0,05; г=-0,31, р < 0,05; г=-0,38,
0,1 > р > 0,05 соответственно), а также концентра ции Т4, FT4 с периметром гранул продукта реакции (г = -0,36 и г= -0,34; 0,1 > р > 0,05 соответствен но). Однако при патологии установлены также по ложительные взаимосвязи концентрации Т3, Т4 с фактором формы (г =0,39, р < 0,05 и г =-0,36, 0,1 > р > 0,05 соответственно).
Известно, что тиреоидные гормоны индуцируют синтез а-ГФДГ в клетках [9, 11]. В связи с этим ста новится понятной выявленная положительная взаимосвязь активности а-ГФДГ в лимфоцитах у здоровых женщин с концентрацией тиреоидных гормонов и отрицательная - с уровнем ТТГ. У больных женщин обнаружена инверсия взаимосвя зи тиреоидных гормонов с активностью данного фермента. Следовательно, наличие аутоиммунного процесса в организме не изменяет "точек приложе ния" метаболического действия гормонов, но трансформирует направленность регуляции.
При обследовании группы здоровых женщин обнаружены также корреляционные связи между концентрацией кортизола в сыворотке крови и морфоденситометрическими показателями НЭ в лимфоцитах. При этом выявлена взаимосвязь с НЭ как с локально распределенными гранулами (с площадью, периметром, усредненным расстояни ем между гранулами: г =0,78, г =0,74, г =0,87; р < 0,01, с интегральной оптической плотностью гранул: г = 0,72, р < 0,05 соответственно), так и с диффузно распределенными (с оптической плот ностью и интегральной оптической плотностью: г = 0,63 и г = 0,66; р < 0,05 соответственно). НЭ является катаболическим ферментом [7, 15]. Уста новленные положительные взаимосвязи морфо- денситометрических параметров НЭ в лимфоцитах крови и концентрации кортизола позволяют пред положить четкую регуляцию активности фермента данным гормоном, который, как известно, индуци рует катаболические процессы в иммунокомпе тентных клетках [
Таким образом, морфоденситометрический анализ активности а-ГФДГ и НЭ в лимфоцитах крови здоровых женщин и больных АИТ позволил выявить различия, определяющие метаболические особенности иммунокомпетентных клеток. При АИТ установлено локальное повышение активно сти а-ГФДГ в лимфоцитах, проявляющееся в виде повышения оптической плотности гранул. По скольку при этом отсутствует повышение площади гранул диформазана, можно сделать заключение о том, что активация фермента происходит не за счет его синтеза. Морфоденситометрический анализ также позволил обнаружить увеличение активно сти НЭ, что отражает повышение деструктивных реакций в иммунокомпетентных клетках при ис следуемом аутоиммунном процессе. Кроме того, у лиц с АИТ выявлены регуляторные изменения влияния тиреоидных гормонов, ТТГ, кортизола на активность НЭ и а-ГФДГ в лимфоцитах.
Выводы
The authors declare that there are no conflicts of interest present.