Патология щитовидной железы занимает первое место в структуре эндокринных заболеваний (0,5% населения), опережая даже сахарный диабет (0,4%). К числу наиболее распространенных заболеваний щитовидной железы относится диффузный токсический зоб (ДТЗ, болезнь Грейвса). В настоящем исследовании для нескольких возможных генов-кандидатов были разработаны полиморфные маркеры и проведено изучение ассоциации этих маркеров с развитием ДТЗ в русской популяции. Обследовали 78 больных с ДТЗ и 153 здоровых донора. Изучение ассоциации полиморфных микросателлитных маркеров D6S2414 и D6S1271, расположенных на хромосоме 6 среди генов главного комплекса гистосовместимости (локус МНС), показало, что оба маркера ассоциированы с ДТЗ.
Использование полиморфного маркера Ala 17Thr гена сериновой эстеразы цитотоксических Т-лимфоцитов (СТLA4) также позволило обнаружить выраженную ассоциацию этого маркера с ДТЗ. Аллель Ala и генотип Ala/Ala повышают риск развития патологии (относительный риск — OR = 2,94 и 3, 57 соответственно), тогда как носительство аллеля Thr и особенно гомозиготность по нему сцеплены с пониженным риском развития ДТЗ (OR = 0,34 и 0,28 соответственно). В случае полиморфного маркера His60Arg гена, кодирующего /3-субъединицу большой многофункциональной протеосомы (LMP2), не обнаружено ассоциации этого маркера с ДТЗ. В случае полиморфного маркера Pro52Thr гена рецептора тиреотропина (TSHR) также не обнаружено ассоциации с ДТЗ в московской популяции. При сравнении распределения аллелей и генотипов полиморфного минисателлитного маркера, расположенного в интроне 2 гена антагониста рецептора интерлейкина-1, в группах здоровых доноров и больных с ДТЗ были показаны достоверные различия во встречаемости аллеля 2 и генотипов 2/4 и 4/4. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о важной роли локуса МНС, гена сериновой эстеразы цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4) и гена антагониста рецептора интерлейкина-1 в развитии ДТЗ в популяции Москвы.
Thyroid pathology ranks first in the incidence of endocrine diseases (0.5% of the general population), by passing ahead of even diabetes mellitus (0.4%). The most common thyroid diseases include diffuse toxic goiter (DTG) - Graves' disease. In this study, polymorphic markers were developed for some possible gene candidates and the association of these markers with the development of DTG was studied in a Russian population. A group of 78patients with DTG and a group of 153 healthy volunteers were examined. Examining the association of the polymorphic microsatellite markers D6S2414 and D6S1271 located on chromosome 6 amongst the genes of the major histocompatibility complex (MNS locus) indicated that both markers are associated with DTG.
The use of the polymorphic marker Ala 17Thr of a cytotoxic T-lymphocytic serine esterase gene (CTLA4) also could detect the marked association of this marker with DTG. The allele Ala and the genotype Ala/Ala increase a risk for the pathology (OR = 2.94 and 3.57, respectively) whereas the carriage of the allele Thr and particularly its homozygosis are linked with a lower risk for DTG (the relative risk (RR) is 0.34 and 0.28, respectively). In case of the polymorphic marker His60Arg if the gene encoding for the /3-subunit of a large multifunctional proteosome (LMP2), there was no association with DTG in a Moscow population. Comparing the distribution of the alleles and genotypes of the polymorphic minisatellite marker arranged in the intron 2 of an interleukin-1 receptor antagonist gene in the groups of healthy volunteers and patients with DTG showed significant differences in the occurrence of allele 2 and genotypes 2/4 and 4/4. Thus, the findings suggest that the MNS locus, the cytotoxic T-lymphocytic serine esterase gene (CTLA4), and the interleukin-1 receptor antagonist gene (IL1RN) play an important role in the development of DTG in the population of Moscow.
Диффузный токсический зоб (ДТЗ, болезнь Грейвса) и аутоиммунный тиреоидит (АИТ) относятся к аутоиммунным заболеваниям щитовидной железы, многофакторная природа которых была установлена еще в 80-х годах прошлого века. Эти болезни щитовидной железы являются одними из наиболее распространенных аутоиммунных заболеваний. Они поражают до 0,5% населения и по своей встречаемости опережают даже сахарный диабет типа 1, причем женщины болеют ДТЗ в 9 раз чаще мужчин [
Известно, что при ДТЗ аутоантитела к рецептору ТТГ, которые часто называют тиреостимулирующими иммуноглобулинами, связываются с рецептором ТТГ [
Общеизвестными маркерами всех аутоиммунных заболеваний являются гены главного комплекса гистосовместимости класса II, расположенные в локусе МНС (или HLA) на хромосоме 6р21. По всей видимости, участие локуса HLA в патогенезе ДТЗ связано с нарушениями иммунотолерантности. Аберрантная экспрессия молекул МНС в клетках, синтезирующих нативный тиреотропин (TSH), может приводить к появлению функциональных аутоантител к нему и индукции заболевания. Для анализа ассоциации локуса МНС с ДТЗ в данной работе использовали тетрануклеотидные микросателлитные маркеры D6S2414 и D6S1271, расположенные между генами МНС класса II.
Ассоциация с ДТЗ показана и для других генов, расположенных в локусе МНС, но не относящихся к генам HLA. Это семейство генов LMP, кодирующих субъединицы большой многофункциональной протеазы — сложного внутриклеточного фермента, осуществляющего процессинг антигенов. Ген LMP2, кодирующий р-субъединицу большой многофункциональной протеазы 2, осуществляет расщепление белков на пептиды, которые затем поступают в эндоплазматический ретикулум, где вступают во взаимодействие с молекулами МНС класса I. В этом гене обнаружен мононуклеотид- ный полиморфизм, приводящий к аминокислотному полиморфизму: остатки аргинина (R) или гистидина (Н) в положении 60 аминокислотной последовательности — R60H [
Накоплены многочисленные данные об ассоциации и сцеплении гена CTLA4 (2q33) с рядом аутоиммунных заболеваний, в том числе с поражениями щитовидной железы. Современная модель активации Т-клеток предполагает наличие 2 сигналов: 1-й, специфический сигнал поступает в момент связывания комплекса МНС с антигеном, находящимся на поверхности клетки, представляющей антиген, с Т-клеточным рецептором (TCR), а 2-й, неспецифический сигнал поступает после соединения другого рецептора Т-клетки (CD28) с его лигандами В7-1 (CD80) и В7-2 (CD86), также находящимися на поверхности клетки, представляющей антиген. Часто 2-й сигнал называют костиму- лирующим. Если оба сигнала поступили, то имеют место активация Т-клетки, секреция цитокинов и дальнейшая пролиферация Т-клетки. Однако ситуация усложнилась после обнаружения другого рецептора (CTLA-4) с противоположным действием, связывающегося с теми же лигандами В7-1 и В7-2, но переводящего Т-клетку в состояние "безответности" к данному антигену, называемое анергией, за которой следует программируемая смерть Т-клетки (апоптоз).
Нарушения в тонком взаимодействии рецепторов CD28 и CTLA-4 с лигандами В7-1 и В7-2 могут являться одной из причин аутоиммунных заболеваний. Например, это может произойти в том случае, если в клетках тимуса часть аутореактивных Т- лимфоцитов, которые должны быть уничтожены, избежит апоптоза. В этом случае уцелевшие аутореактивные Т-лимфоциты уходят на периферию и до конца жизни могут не активироваться, однако возможен и другой вариант развития событий, при котором под воздействием внешних факторов могут произойти активация аутореактивных Т-лимфоцитов и развитие аутоиммунного заболевания. Ген CTLA4 является одним из наиболее вероятных генов-кандидатов, предрасполагающих к ДТЗ, и для изучения его ассоциации с ДТЗ использовали полиморфный маркер Alal7Thr (в положении 7 лидерного пептида), связанный с мононуклеотидным полиморфизмом (А -> G) в положении 49 экзона 1 (A49G) [1, 7].
Аутоиммунные поражения щитовидной железы часто сопровождаются воспалительными процессами, поэтому в числе генов-кандидатов, вовлеченных в развитие ДТЗ, могут рассматриваться гены, продукты которых являются медиаторами воспалительной реакции. К ним относится ген антагониста рецептора интерлейкина-1 (ILIRN), расположенный на хромосоме 2ql4.2, внутри которого находится полиморфный минисателлит [
Материалы и методы
В группу популяционного контроля вошли 153 донора (81 мужчина и 72 женщины) без патологии щитовидной железы (средний возраст 36,4 ± 10,4 года). Другую группу составили 78 больных с ДТЗ (14 мужчин и 64 женщины) в возрасте 39,3 ± 11,6 года с длительностью заболевания 4,1 ± 2,8 года. Группа обследованных состояла из лиц, наблюдавшихся на кафедре эндокринологии и диабетологии ФППО ММА им. И. М. Сеченова.
Термостабильная ДНК-полимераза Taq получена от фирмы "Ферментас" (Вильнюс, Литва), протеиназа К — от фирмы "Merck" (Германия). Синтез олигонуклеотидных праймеров выполнен ОАО "Синтол" (Москва). Геномную ДНК выделяли из цельной крови больных посредством фенол-хлороформной экстракции после инкубации образцов крови с протеиназой К в присутствии 0,1% SDS [
ДНК амплифицировали методом ПЦР на термоциклерах РНС-2 ("Techne", Великобритания) и "Терцик" (Россия) в 50 мкл реакционной смеси, содержащей буфер 1 или 2, по 0,2 мМ каждого dNTP, по 10 пмоль каждого из праймеров, 100—200 нг геномной ДНК и 1,0 ед. ДНК-полимеразы Taq. Буфер 1 содержал 67 мМ трис-НС1 (pH 8,8), 16,6 мМ сульфат аммония и 0,1% твин-20. Концентрация хлорида магния зависела от амплифицируемого локуса. Буфер 2 содержал 10 мМ трис-НС1 (pH 8,8), 50 мМ КС1 и 1,5 мМ MgCl2. При необходимости в реакционную смесь вносили ДМСО в конечной концентрации 10%.
На первой стадии ПЦР ДНК денатурировали при 94°С 3 мин, на конечной — проводили синтез 2-й цепи при 72°С 7 мин. В промежутке между данными стадиями осуществляли 25—35 циклов ПЦР в зависимости от локуса и количества исходной ДНК по трехступенчатой программе, включающей в себя денатурацию ДНК при 94°С 1 мин, отжиг праймеров в течение 1 мин и синтез 2-й цепи при 72°С 1 мин. Температура отжига праймеров зависела от амплифицируемого локуса. Условия ПЦР и
Таблица 1 Условия ПЦР и последовательность праймеров для амплификации полиморфных маркеров, использованных в данной работе | |||||
Полиморфный маркер | Прямой и обратный праймеры (5' -> 3') | Источник | Буфер | MgCl2, мМ | Отжиг, °C |
D6S2414 в локусе HLA | aactgggctgagatgtacca aaggagaggaatgtgtgtgc | [91 | 2 (+10% ДМСО) | 1,5 | 55 |
D6S1271 в локусе HLA | tagactgatgagcggtaccc cctggggtgtaatattgctg | [6] | 1 (+10% ДМСО) | 1,0 | 60 |
Alal7Thr гена CTLA4 | cgaagagtgaagtgcacagg cacagtctttattcttcagcg | [51 | 2 (+10% ДМСО) | 1,5 | 60 |
Минисателлит в гене IL1RN | ctccgcaaccactccctat tcctggtctgcacctaa | [8] | 1 | 1,0 | 55 |
R60H в гене LMP2 | gccaggaagagccgaaacaag gtgaaccgagtgtttgacaagc | [14] | 2 (+10% ДМСО) | 1,5 | 60 |
Pro52Thr в гене TSHR | gaggatggagaaatagccccgag cactacttcgggctgttattgag | [3] | 2 (+10% ДМСО) | 1,5 | 65 |
последовательности праймеров для амплификации исследованных локусов приведены в табл. 1.
Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР проводили в 12% полиакриламидном геле, который затем окрашивали нитратом серебра [
Для идентификации аллелей полиморфного маркера гена LMP2 использовали рестриктазу Hin6I, в случае полиморфного маркера гена CTLA4
Значимость различий между частотами аллелей и генотипов исследованных полиморфных маркеров в группах определяли с помощью точного критерия Фишера с поправкой Бонферрони, учитывающей число аллелей и генотипов. Значимыми считали различия при р < 0,05. Для оценки роли генетического маркера (аллеля или генотипа) в развитии ДТЗ рассчитывали значения относительного риска (OR). OR = 1 рассматривали как отсутствие ассоциации, OR > 1 — как фактор риска и OR < 1
Результаты и их обсуждение
Для маркера D6S2414 было обнаружено 9 аллелей, содержащих от 5 до 13 повторов (по числу повторяющихся единиц gata). Значимыми оказались различия в распределении частот для аллелей 5, 6, 8, 12, причем содержание аллелей 5, 6 и 12 у больных было снижено, а аллеля 8 — повышено, что отражает величина OR, т. е. пациенты — носители аллелей 5, 6 и 12 в большей степени предрасположены к развитию ДТЗ, в то время как носители аллеля 8, по всей видимости, имеют меньший риск развития ДТЗ (табл. 2).
Для маркера D6S1271 было обнаружено 4 аллеля, содержащих от 10 до 13 повторов. У пациентов с ДТЗ достоверно повышена частота аллеля 10 по сравнению с контрольной группой. Аллель 10 обладает наибольшим значением OR (4,95). Следовательно, данный аллель можно рассматривать в качестве своеобразного маркера повышенного риска развития ДТЗ. В то же время у больных существенно снижено содержание аллеля 13, характеризующегося минимальными значениями OR, что формально свидетельствует о его предохраняющей роли по отношению к раннему развитию аутоиммунной патологии. Достоверные различия показаны и в распределении генотипов маркера D6S1271. У пациентов с ДТЗ по сравнению с контролем существенно повышена доля генотипа 10/12. Носительство генотипа 10/12 ассоциировано с максимальным (OR = 4,99) риском развития ДТЗ.
Таким образом, наличие значимых различий во встречаемости 4 аллелей для маркера D6S2414 и 2 аллелей и 1 генотипа для маркера D6S1271 наглядно свидетельствует о выраженной ассоциации этих маркеров и окружающей их хромосомной области 6р21.31 с развитием ДТЗ в московской популяции.
Сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера R60H гена LMP2 в группах с ДТЗ и в популяционном контроле выявил тенденцию к накоплению аллеля R и особенно генотипа RR (в 2,5 раза) у больных с ДТЗ по сравнению с контролем. Достоверным было лишь возрастание содержания генотипа RR, значимость которого исчезала при введении поправки Бонферрони (см. табл. 2). В настоящий момент не совсем ясно, ассоциирован ли полиморфный маркер R60H гена LMP2 с развитием ДТЗ. Во всяком случае, в популяции Москвы предрасполагающий эффект данного генотипа выражен сильнее, чем предохраняющая роль гомозигот НН, но при этом выраженная связь с патологией у полиморфного маркера R60H гена LMP2 отсутствует.
В нашей работе также обнаружена выраженная ассоциация полиморфного маркера Alal7Thr гена CTLA4 с ДТЗ. Из табл. 2 видно, что носители молекулярного варианта Т-клеточной эстеразы, несущей остаток аланина в положении 17 (аллель Ala 17), и гомозиготные носители этого аллеля имеют повышенный риск развития ДТЗ (OR = 2,94 и 3,57 соответственно), тогда как носители аллеля Thr 17 и особенно гомозиготные носители этого аллеля имеют пониженный риск развития ДТЗ в московской популяции (OR = 0,34 и 0,28 соответственно).
Таблица 2
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров в группах больных с ДТЗ и здоровых индивидов
Аллели и значимые генотипы
Частоты аллелей и генотипов | |
здоровые | больные с дтз |
OR
Значения критерия Фишера
Значения критерия Фишера с учетом поправки Бонферрони
D6S2414
5 | 0,079 | 0,006 | 0,24 | 0,00035 | 0,00315 |
6 | 0,139 | 0,038 | 0,34 | 0,00043 | 0,00344 |
7 | 0,046 | 0,096 | — | 0,03044 | > 0,05 |
8 | 0,089 | 0,173 | 2,37 | 0,00652 | 0,03912 |
9 | 0,175 | 0,237 | — | > 0,05 | — |
10 | 0,199 | 0,250 | — | > 0,05 | — |
11 | 0,156 | 0,154 | — | > 0,05 | — |
12 | 0,106 | 0,026 | 0,33 | 0,00131 | 0,00917 |
13 | 0,010 | 0,019 | — | > 0,05 | — |
D6S1271
10 | 0,015 | 0,083 | 4,95 | 0,00199 | 0,00597 |
11 | 0,054 | 0,083 | — | > 0,05 | — |
12 | 0,847 | 0,821 | — | > 0,05 | — |
13 | 0,084 | 0,013 | 0,24 | 0,00178 | 0,00712 |
10/12 | 0,030 | 0,154 | 4,99 | 0,00326 | 0,02608 |
Ген CTLA4
Ala | 0,527 | 0,782 | 2,94 | < 0,00001 | < 0,00001 |
Thr | 0,473 | 0,218 | 0,34 | < 0,00001 | < 0,00001 |
Ala/Ala | 0,323 | 0,641 | 3,57 | 0,00003 | 0,00009 |
Thr/Thr | 0,269 | 0,077 | 0,28 | 0,00087 | 0,00174 |
Ген LMP2
н | 0,763 | 0,679 | — | > 0,05 | — |
R | 0,237 | 0,321 | — | > 0,05 | — |
RR | 0,062 | 0,154 | - | 0,03540 | > 0,05 |
Ген IL1RN | |||||
2 | 0,280 | 0,385 | — | 0,02739 | > 0,05 |
3 | 0,033 | 0,019 | — | > 0,05 | — |
4 | 0,615 | 0,564 | — | > 0,05 | — |
5 | 0,044 | 0,019 | — | > 0,05 | — |
6 | 0,027 | 0,013 | — | > 0,05 | — |
2/4 | 0,374 | 0,615 | 2,61 | 0,00139 | 0,0139 |
4/4 | 0,363 | 0,231 | 0,04460 | > 0,05 |
Ген TSHR
Pro | 0,744 | 0,75 | — | > 0,05 | — |
Thr | 0,256 | 0,25 | — | > 0,05 | — |
В интроне 2 гена IL1RN расположен полиморфный минисателлит, состоящий из повторяющихся звеньев размером 86 п. н. При генетическом анализе было выявлено 5 аллелей. Сравнительный анализ выявил достоверные различия в частотах аллеля 2 и 2 генотипов (2/4 и 4/4) между группой здоровых доноров и больными с ДТЗ. У последних содержание данного аллеля (38,5%) и гетерозигот 2/4 (61,5%) было существенно повышено, тогда как доля гомозигот 4/4 (23,1%) значительно уменьшена по сравнению с контролем. Таким образом, генотип 2/4 (OR = 2,61) может служить маркером риска развития ДТЗ (см. табл. 2). Возможно, ген IL1RN ассоциирован с ДТЗ в московской популяции.
Проведенный нами анализ полиморфного маркера Pro52Thr гена рецептора ТТГ не показал ассоциации с заболеванием (см. табл. 2). В настоящий момент неясно, связано ли это с тем, что ген TSHR не вовлечен в патогенез ДТЗ, либо только с тем, что использованный нами полиморфный маркер не ассоциирован с ДТЗ. Нельзя исключить, что какой- либо другой полиморфный маркер в гене TSHR может быть ассоциирован с развитием аутоиммунного ДТЗ. В ближайшее время планируется осуществить анализ ассоциации с ДТЗ ряда других маркеров этого гена.
Выводы
The authors declare that there are no conflicts of interest present.