Неотъемлемым для функционирования клеток организма человека является образование активированных кислородных метаболитов (АКМ: О2, Н2О2, ОН, NO, RO, и др.) [3]. Эти высокореакционные соединения обладают широким спектром биологического действия: NO-радикалы регулируют тонус сосудов, ингибируют адгезию гранулоцитов и агрегацию тромбоцитов [13], оказывают противоопухолевое и мутагенное действие [15]; Н2О2 и гипогалоиды важны для микробицидного действия нейтрофилов [10, 16]; О2 индуцирует [2], а NO ингибирует пролиферацию лимфоцитов [12]. В физиологических условиях образование АКМ в клетках сдерживается на низком уровне системой ферментативных и неферментативных антиоксидантов [1, 7]. При патологических состояниях баланс в системе АКМ-антиоксиданты может нарушаться; преобладание продукции АКМ в результате повышения их образования или истощения антиоксидантов сопровождается активацией деструктивных процессов, что получило название "окислительный стресс" [19]. Помимо деструктивных воздействий, АКМ (радикалы) выполняют и регуляторные функции. Развитие окислительного стресса установлено при многих заболеваниях и патологических состояниях. В некоторых случаях АКМ и окислительные реакции с их участием становятся главным патогенетическим фактором заболевания. В нормальных условиях во всех клетках и мембранных структурах протекают свободнорадикальные реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ), развитие которых сдерживается жирорастворимыми антиоксидантами. Важную роль в ингибировании ПОЛ играет структурная организация мембран, поэтому различные повреждения структуры живой клетки неизбежно приводят к активации ПОЛ. Процессы ПОЛ являются компонентом и первичным медиатором стресс-реакции по Се- лье [7]. В наших предыдущих исследованиях у беременных доказано участие в механизмах сахарного диабета (СД) усиленного ПОЛ цитомембран, которое приводит к деструкции липидного матрикса, нарушению мембранной проницаемости, деятельности важнейших ферментов и изменению функционального состояния мембрано-рецепторного комплекса [7]. Целью настоящего исследования явилось изучение состояния системы ПОЛ-антиоксиданты у беременных, больных СД типа 1. Материалы и методы Состояние системы ПОЛ-антиоксиданты изучено у 98 женщин с СД типа 1 в III триместре беременности: из них 16 женщин наблюдались в родах и через 1 ч, 1 сут и 5-7 сут после родов. Возраст больных составил 18-40 лет (средний возраст 26 ± 5,4 года), срок заболевания - от 5 до 16 лет, суточная доза инсулина - в среднем 72 ЕД. К моменту исследования больные находились в состоянии компенсации СД, что подтверждалось нормогликемией натощак и в течение дня, аглюкозурией. Контрольную группу составили 30 беременных женщин без эндокринной патологии и 11 небеременных женщин с СД типа 1, имевших инсулинорезистентность по инсулиновым кривым. Объектом исследования служили мембраны эритроцитов (МЭ) и лимфоциты. Об интенсивности ПОЛ в выделенных плазматических МЭ судили по содержанию малонового диальдегида (МДА) и гидроперекисей (ГП), которое оценивали в реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [17]. Антиокисли- тельную активность (АОА) крови определяли по способности плазмы тормозить накопление ТБК-активных метаболитов ПОЛ в суспензии желточных липопротеидов [4]. Активность каталазы определяли по методу [5] на основе реакции разложения Н2О2. Активность CuZn-супероксиддисмугазы (CuZnSOD) исследовали путем измерения процента торможения скорости реакции восстановления нитросинего тетразолия при неферментном образовании супероксидного радикала [9]. Количество инсулиновых рецепторов определяли по описанному нами методу [7]. Связывание 1251-инсулина с рецепторами цитомембран исследовали по методу [14] с использованием метода вытеснения 1251-инсулина из комплекса с рецепторами возрастающими количествами немеченого гормона в условиях равновесия [14]. Общее количество инсулинсвязываюших мест и сродство рецепторов к гормону определяли по L. Scatchard [18], Р. De Meyts и I. Roth [11]. чувствительность клеток к инсулину оценивали по степени утилизации глюкозы клетками [7]. Коэффициент упорядоченности и гидрофобности эритроцитарных мембран, а также концентрацию тиоловых групп изучали методом электронно-парамагнитно-резонансной спектроскопии с помощью спиновых зондов на радиоспектре Е-4 ("Varian", США). Статистический анализ данных проводили с помощью программы для персонального компьютера, разработанной на кафедре медицинской и биологической кибернетики РГМУ, с использованием статистических критериев, не зависящих от характера распределения, - точного метода Фишера, критерия х2, /-критерия Стьюдента. Значимость коэффициентов корреляции определяли с использованием Z-преобразования Фишера по критерию Стьюдента (/-критерий). Результаты и их обсуждение Как видно на рис. 1, при 2-часовой инкубации эритроцитов с инсулином in vitro в концентрациях 20, 80 и 1000 пг/мл у беременных женщин с СД типа 1 в прямой зависимости от дозы инсулина происходит возрастание коэффициента упорядоченности и снижение коэффициента гидрофобности (МЭ) по сравнению с интактными клетками на 30% (р < 0,05). Использование инсулина приводит к повышению "жесткости” и гидрофильности цитомембран, что может свидетельствовать о глубоких метаболических нарушениях в клетке, в частности об усилении свободнорадикальных реакций ПОЛ (табл. 1). Концентрация метаболитов ПОЛ (МДА, ГП) резко возрастает при введении в систему высоких концентраций инсулина. Как видно из табл. 1, различия в содержании МДА и ГП в эритроцитах, взятых от беременных больных СД типа 1 в контроле и после 2-часовой инкубации их с инсулином в концентрациях 20 и 80 пг/мл. были незначительными. Добавление инсулина к эритроцитам в концентрации 1000 пг/мл усиливало образование МДА и ГП в 2,2 раза и не вызывало изменений в содержании суммарного показателя АОА, т. е. инсулин в высоких концентрациях оказывал прооксидантное действие. Инсулин в больших концентрациях (80 и 1000 пг/мл) усиливал степень утилизации глюкозы эритроцитами. Вероятно, можно говорить об относительной недостаточности активности антиоксидантных ферментов на фоне усиления липидной пероксидации под влиянием высоких концентраций гормона. Аналогичные исследования, проведенные in vitro с отмытыми мононуклеарами (МН), показали, что добавление инсулина Рис. 1. Структурная организация мембран эритроцитов беременных с СД типа 1 при инкубации клеток с инсулином. /V - интактные эритроциты, I, II, Ш - эритроциты, подвергнутые действию инсулина в дозах 20, 80 и 1000 пг/мл соответственно. * - достоверность различий с группой здоровых беременных (р < 0,001). По осям ординат - отн. ед. а - коэффициент упорядоченности; о - коэффициент гидрофобности. в систему в больших концентрациях (1000 пг/мл) приводит к повышению утилизации глюкозы МН на 35% (/> < 0,05, г - 0,78) и возрастанию процента специфического связывания (табл. 2). Определение активности СДГ в лимфоцитах показало, что активность фермента у беременных с СД типа 1 снижена по отношению к контролю в 2 раза, что свидетельствует о нарушениях в энергопродуцирующей системе клеток. При внесении в систему больших концентраций инсулина отмечается повышение активности СДГ в лимфоцитах и восстановление окислительного метаболизма в них. При изучении с помощью спиновой метки одной из наиболее активных групп белка (SH), т. е. тиоловых групп, играющих антиоксидантную роль, выявлено, что имеет место изменение конформации поверхностных белков, что свидетельствует об их агрегации и полимеризации. Изучение нами при аллоксановом диабете активности Na+, К+-АТФазы подтверждает это предположение. При экспериментальном диабете резко снижается ак- Табл и ца 1 Действие инсулина in vitro на содержание МДА, АОА и утилизацию глюкозы эритроцитами (Л/ ± т) Условие опыта МДА, нмоль/мл АОА, % Утилизация глюкозы, мкмоль/(2 • 109 кл/ч) Контроль 1 (беременные здоровые женщины) Контроль 2 (беременные женщины с СД типа 1] Эритроциты + инсулин 20 пг/мл Эритроциты + инсулин 80 пг/мл Эритроциты + инсулин 1000 пг/мл 3,1 ± 0,7 (и = 15) 3,65 ± 0,06 (п = 12) 3,83 ± 0,08 (п= 11) 3,83 ± 0,08 (л = 7) 8,03 ± 0,9* (п = 7) 61.3 ± 2,48 (л = 15) 52,74 ± 5,15 (п = 12) 56.3 ± 5,2 (л = 11) 50.3 ± 5,8 (л = 7) 49,9 ± 4,8 (л = 7) 1,09 ± 0,15 (п = 10) 0,88 ± 0,03 (п = 9) 0,91 ± 0,04 (л = 11) 1,07 ± 0,4* (л = 7) 1,59 ± 0.08* (л = 7) Примечание. Здесь и в табл. 2: * - достоверность различий с контролем 2. Таблица 2 Действие инсулина in vitro на утилизацию глюкозы, процент специфического связывания и активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в лимфоцитах (Л/ ± т) Процент специ- Условие опыта мкмоль/(б ■ 10’ кл/ч) СДГ, ед. фи чес кого связывания 1251- инсулина Контроль 1 (бере- менные здорове 0,73 ± 0,04 16,8 ± 1,7 28,3 ± 2,9 женщины) (л = 8) (л = 6) (л = 15) Контроль 2 (бере менные женщи 0,49 ± 0,03 8,2 ± 0,01 21,7 ± 2,0 ны с СД типа 1) (л = 7) (л = 7) (п = 10) Лимфоциты + ин 0,46 ± 0,07 8,2 ± 0,03 20,7 ± 2,1 сулин 20 пг/мл (л = 8) (л = 6) (л = 8) Лимфоциты + ин 0,67 ± 0,05* 10,2 ± 0,09 23,1 ± 3,3 сулин 80 пг/мл (л = 7) (л = 7) (л = 7) Лимфоциты + ин 0,99 ± 0,08* 14,3 ± 2,1* 28,4 ± 2,1* сулин 1000 пг/мл (л = 6) (л = 5) (л = 7) тивность этого фермента в мембранах эритроцитов и почечной ткани у животных [8]. Содержание глутатиона, восстанавливающего в физиологических условиях метгемоглобин в оксигемоглобин и обеспечивающего высокую концентрацию оксигемоглобина в тканях, в Рис. 2. Анализ инсулинрецепторного взаимодействия у беременных с СД типа 1. Здесь и на рис. 3: а - кривые конкурентного вытеснения 12Ч-инсулина немечен- ным инсулином в разных концентрациях в эритроцитах здоровых женщин (/) и больных СД (2). По осям ординат - специфическое связывание ,251-инсулина эритроцитами (в % от общего инсулина при расчете на 2,0 • 10” клеток/мл); по осям абсцисс - логарифм концентрации немеченного инсулина (в нг/мл); б - те же данные в координатах графика Скэтчарда. По осям ординат - отношение связанного 1251-инсулина к свободному; по осям абсцисс - связанный инсулин (в нг/мл) в расчете на 2,0 ■ 10’ клеток/мл. % нг/мл 1 2 3 4 S 6 7 д 9 Ю 11 12 Рис. 3. Показатели уменьшения количества рецепторов у беременных с СД I. условиях окислительного стресса у больных с СД типа I снижается в 2,5 раза (/> < 0,01). Концентрация тиоловых групп, входящих в состав липопротеидных комплексов МЭ у беременных с диабетом, снижается в 1,9 раза (р < 0,05). Активность CuZnSOD снижается в 1,9 раза (р < 0,05). SOD, находящаяся в мембране, осуществляет аннигиляцию радикалов внутри клетки, в результате чего образуется перекись водорода. Образующиеся в результате дисмутации ион-радикалов молекулы перекиси водорода в цитоплазме разлагаются на воду и кислород с помощью каталазы (в митохондриях, пероксисомах, лизосомах и в цитоплазме). Активность каталазы в III триместре беременности у женщин с СД снижается в 6,3 раза (р < 0,001). Таким образом, при СД у беременных женщин резко снижается уровень антиоксидантов ферментной и неферментной природы вследствие полимеризации белков, что может служить причиной снижения активности протеинкиназы. т. е. инсулинового рецептора, являющегося интегральным белком в липидном матриксе мембраны. Изучение инсулинрецепторных связей у больных с СД типа 1, имевших "инсулинорезистентность" (ежедневная доза инсулина превышала 60 ЕД), показало, что к моменту обследования метаболические нарушения были компенсированы, что подтверждалось нормогликемией натощак и отсутствием кетоацидоза. Специфическое связывание инсулина рецепторами на эритроцитах оказалось значительно меньшим, чем у здоровых, причем это снижение определялось уменьшением концентрации рецепторов на эритроцитах (р < 0,05) (рис. 2). В последний триместр беременности (при нормогликемии натощак и в течение дня, отсутствии кетоацидоза) связывание инсулина рецепторами на эритроцитах было значительно снижено по сравнению со здоровыми женщинами с беременностью таких же сроков. Как видно на рис. 3, это снижение связано с уменьшением концентрации рецепторов на клетках и в меньшей степени - со снижением сродства рецепторов к инсулину. Во время родов в венозной крови процент связывания |251- инсулина с эритроцитами у рожениц снижается; в пуповинной крови инсулинсвязывающая активность снижается более чем в 2 раза. Через 1 ч и через 1 сут после родоразрешения у больных с СД типа 1 отмечается возрастание процента специфического связывания |251-инсулина до исходных значений за счет повышения как количества, так и сродства свободных и максимально занятых инсулиновых рецепторов. Через 5-7 сут после родов процент связывания вновь снижается. Концентрация МДА в эритроцитах до и во время родов мало отличается от контрольных значений. Однако после родов концентрация МДА в эритроцитах резко возрастает, но при стабильно нормальном уровне АОА, что свидетельствует о компенсации имеющегося дисбаланса в системе ПОЛ-АОА (г от -0,63 до -0,67). Выводы 1. При СД у беременных происходит ассоциированное с глюкозой окислительное повреждение мембран клеток за счет активации свободнорадикальных реакций ПОЛ. 2. У беременных с СД отмечается дисбаланс в системе ПОЛ-антиоксиданты вследствие резкого повышения степени переокисления липидов на фоне снижения функционирования антиоксидантов ферментной (каталазы, CuZnSOD) и неферментной (тиоловые группы, глутатион) природы. 3. Окислительный стресс у беременных с СД типа 1 приводит к снижению инсулинсвязывающей активности клеток крови в результате полимеризации мембранных белков.