Гипогликемия - состояние, связанное с передозировкой инсулина в ходе лечения сахарного диабета и с гиперпродукцией гормона при инсулиноме поджелудочной железы, приводит к постгипогликемической энцефалопатии, механизмы развития которой требуют дальнейшего изучения [2, 5, 11, 12]. Одной из причин возникновения энцефалопатий различного генеза являются нарушения процессов дезаминирования в нервной ткани, поскольку дезаминаты мозга катализируют реакции синтеза и катаболизма нейромедиаторов и энергетического обмена. Активность МАО в БА (а) и СТ (б) мозга крыс в восстановительном периоде после однократной и возобновляющейся инсулиновой гипогликемии (М ± т). 1, 2, 3, 4, 5 - группы животных. / - серотонин; II - триптамин; III - дофамин; IV - глюкозамин. В каждой серии было по 5-8 животных. Звездочкой обозначены статистически достоверные изменения (р < 0,05). По осям ординат - активность МАО (в нмоль/мин/мг белка). В настоящей работе исследована активность дезаминирующих ферментов в мозге крыс в состоянии гипогликемической комы (ГГК) и в восстановительном периоде после однократной и возобновляющейся тяжелой инсулиновой гипогликемии. Материалы и методы Опыты выполнены на белых беспородных крысах обоего пола массой 180-200 г. Все животные содержались на обычном рационе и перед опытом голодали в течение 18-24 ч. Воду получали без ограничения. Экспериментальные животные были разделены на следующие группы: 1-я - интактные животные (контроль); 2-я - крысы, находящиеся в состоянии ГГК; 3-я - через 12 ч после купирования ГГК; 4-я - через 48 ч после купирования комы; 5-я - животные, перенесшие 5-7 ГГК с интервалом 2 дня и декапитированные на 2-е сутки после последней комы. ГГК (содержание глюкозы в крови менее 1 ммоль/л) вызывали внутримышечной инъекцией инсулина в дозе 40 ЕД на 1 кг массы, купирование проводили ведением коматозным животным 30 мл 40% раствора глюкозы в желудок. Исследовали ткани больших полушарий (БП) и ствола (СТ) мозга. Суммарную фракцию митохондрий получали методом дифференциального центрифугирования. Активность моноаминоксидазы (МАО, КФ 1.4.3.4) определяли, используя в качестве субстратов серотонин креатининсульфат, тирамин гидрохлорид, дофамин гидрохлорид в концентрациях, оптимальных для митохондрий головного мозга крыс [1], и глюкозамин в конечной концентрации 10 мМ. После изотермической отгонки по Конвею и несслеризации содержание аммиака определяли спектрофотометрически. Глутаминазную (ГЛТ, КФ 3.5.1.2) и аденозинмонофосфатдезаминазную (АМФ-Д, КФ 3.5.4.6) активности также оценивали по накоплению аммиака. Среда инкубации при определении активности ГЛТ включала в себя калий-фосфатный буфер pH 7,6, 50 мМ глутамина, 10 мМ АТФ и 0,1-0,2 мг белка митохондрий, при определении АМФ-Д - 10 мМ АМФ, 5 мМ АТФ и 0,1-0,2 мг белка цитоплазматической или митохондриальной фракции. Пробы инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Реакцию останавливали охлаждением проб до 0°С, белки осаждали ТХУ с последующим центрифугированием. К 0,05-0,2 мл супернатанта прибавляли 5 мл безаммиачной воды, 0,1 мл реактива Несслера и регистрировали изменение оптической плотности при 400 нм в течение 15 с [4]. Активность глутаматдегидрогеназы (ГДГ, КФ 1.4.1.3) оценивали спектрофотометрически [6]. Количество белка определяли по Лоури. Результаты экспериментов обрабатывали статистически с применением г-критерия Стьюдента. Результаты и их обсуждение У крыс, находящихся в состоянии ГГК, обнаружено уменьшение активности МАО в БП и СТ при использовании в качестве субстратов серотонина, триптамина и дофамина на 17- 28%, более выраженное и статистически достоверное в структурах СТ, и отмечена тенденция к увеличению накопления аммиака при инкубации митохондриальной фракции с глюкоза- мином (30-36%; р > 0,05) (см. рисунок). Активность ГЛТ оказалась сниженной на 10%, АМФ-Д увеличивалась на 15% в исследованных отделах мозга (см. таблицу). Через 12 ч после купирования ГГК статистически достоверных изменений большинства исследованных показателей не обнаружено. У крыс, забитых через 48 ч после купирования первой комы и на 2-е сутки после купирования последнего эпизода гипогликемии из серии ГГК. выявлено уменьшение активности МАО на 20-29% при использовании природных субстратов фермента и выраженное увеличение скорости дезаминирования глюкозамина (в 2-3 раза) в исследованиях отделов мозга. У животных, перенесших серию гипогликемических ком, наблюдали также увеличение активности АМФ-Д в БП и СТ, более выраженное в цитоплазматической фракции (22-45%), при этом активность ГЛТ оказалась сниженной в СТ на 15%, а в БП - на 33%. Изменений активности ГДГ во всех сериях эксперимента не выявлено. МАО обнаруживает высокую чувствительность к окислительному стрессу, которая выражается в снижении активности при использовании специфических субстратов, и к расширению спектра относительной специфичности фермента [3]. В этом отношении выявленные изменения активности МАО полностью согласуются с обнаруженным ранее уменьшением толерантности к окислительному стрессу нервной ткани животных, подвергнутых многократной гипогликемии [10], и связаны, по-видимому, с окислением тиоловых групп фермента активными формами кислорода. С другой стороны, окисление МАО веществ, в норме не являющихся субстратами фермента, приводит к увеличению продукции активных форм кислорода и дальнейшей активации пероксидного окисления липидов (ПОЛ), ускорению катаболизма компонентов клеточных мембран, а также к дополнительному образованию аммиака в нервной ткани. Скорость АМФ-Д-реакции существенно зависит от величины аденилатного энергетического заряда [8]. Нейрогликопения является энергодефицитным состоянием и сопровождается накоплением АМФ в мозге [13], с чем может быть связано увеличение активности АМФ-Д, выявленное в настоящем исследовании. Регенерация АМФ из инозинмонофосфата требует аспар- Активность АМФ-Д, ГЛТ и ГДГ (в имоль/мин/мг белка) в мозге крыс в восстановительном периоде после однократной и возобновляющейся инсулиновой гипогликемии (М ± т) Показа- Отдел мозга Группа животных тел и 1-я 2-я 3-я 4-я 5-я ;* I* ;* АМФ-Д: надо БП 30,2± 1,4 35,3+1,7* 33,0+1,3 31,4+1,8 39,4±2,2; садок СТ 28,5±1,1 34,2±1,4* 30,9±0,9 30,5+1,3 41,3±2,5' мито БП 32,5+1,6 36,7± 1,8 30,7±1,5 29,9+1,7 39,6±1,9‘ хонд СТ 29,3±1,2 33,6+1,5* 30,1±1,7 28,5±1,6 37,3±1,5‘ рии ГЛТ БП 73,3+0,8 65,5±2,0* 79,8+1,6* 67,1 + 1,3* 49,4±3,2! СТ 64,7±1,3 58,3±2,0* 66,5±1,7 63,4+1,9 55,3±2,7: ГДГ БП 267±18 273± 15 262±20 275 + 15 265±11 СТ 264± 15 261 + 14 273+17 259±21 250±18 '* Примечание. В каждой серии проводили 5-8 опытов. Звездочкой обозначены статистически достоверные изменения (р < 0,05). тата, поэтому одной из причин уменьшения уровня аспартата в нервной ткани в восстановительном периоде после возобновляющейся гипогликемии [9] может быть использование этой аминокислоты в образовании АМФ. Увеличение активности АМФ-Д имеет, по-видимому, неблагоприятные последствия, поскольку именно АМФ-Д-реак- ция служит одним из основных количественно важных источников свободного аммиака в тканях и является лимитирующим этапом катаболизма адениловых нуклеотидов. Образование и последующее окисление гипоксантина и ксантина в ксантиноксидазной реакции сопровождается продукцией супероксид- анион-радикала, что также должно способствовать стимуляции процессов ПОЛ в нервной ткани при гипогликемии. Активность ГЛТ уменьшается в состоянии ГГК, снижена через 48 ч после однократной гипогликемии и на 2-е сутки восстановительного периода после купирования последней из серии гипогликемических ком. ГГК сопровождается освобождением глутамата нервными окончаниями и резким увеличением концентрации глутамата и аспартата во внеклеточном пространстве мозга, что обеспечивает эксайтотоксическую природу повреждения нейронов при гипогликемии [11]. Уровень метаболического пула глутамата и глутамина в нервной ткани в состоянии ГГК, напротив, значительно уменьшается, поскольку эти аминокислоты интенсивно используются в мозге в качестве энергетических субстратов при нейрогликопении [9, 13]. Это приводит к существенному увеличению содержания аммиака в нервной ткани. Вероятно, значительные колебания уровня глутамата, глутамина и аммиака в мозге в состоянии ГГК и в восстановительном периоде являются факторами, приводящими к изменению активности ГЛТ, катализирующей образование в мозге нейтротрансмитгерного пула глутамата [7]. Причиной уменьшения активности ГЛТ при гипогликемии может быть также повреждение фермента в результате окислительного стресса. Независимо от конкретных механизмов снижение активности ГЛТ может иметь значение в уменьшении потенциальных возможностей глутаматергической передачи в ЦНС в результате перенесенной гипогликемии. Таким образом, как в состоянии ГГК. так и в восстановительном периоде наблюдаются изменения субстратной специфичности МАО и активности АМФ-Д, способные приводить к увеличению образования активных форм кислорода и накоплению аммиака в нервной ткани. Это может служить одной из причин повреждения нейронов и иметь значение в развитии постгипогликемической энцефалопатии. Выявленные изменения, по-видимому, являются результатом окислительного стресса [10] и отражают этапы развития эксайтотоксического процесса при гипогликемии и в восстановительном периоде после купирования ГГК глюкозой. Необходимо отметить, что нарушения, возникающие в восстановительном периоде после серии ГГК, более выражены, чем в восстановительном периоде после однократной гипогликемии. Полученные результаты свидетельствуют о том, что многократная гипогликемия создает явно измененный метаболический фон для развития последующих гипогликемий. Таким образом, существенное значение в патогенезе постгипогликемической энцефалопатии может иметь именно то обстоятельство, что гипогликемия в ходе лечения сахарного диабета и при инсуломе поджелудочной железы наблюдается неоднократно [2, 5, 11, 12]. Выводы 1. Тяжелая инсулиновая гипогликемия приводит к изменению субстратной специфичности МАО, увеличению активности АМФ-Д и уменьшению активности ГЛТ в мозге. Выявленные изменения наблюдаются также в восстановительном периоде после купирования комы глюкозой. 2. Нарушения метаболизма в мозге более выражены в восстановительном периоде после неоднократно перенесенной гипогликемии.