Для выделения высокомолекулярной ДНК использовали щитовидные железы людей, удаленные во время операции по поводу зоба в лаборатории тиреоидной патологии Института эндокринологии АН Республики Узбекистан.

Выделение ДНК из клеток щитовидной железы проводили методом фенольной экстракции [2].

Рестрикционный анализ проводили с помощью рестрикционных эндонуклеаз BamHI, Hindlll, НраН, MspI. Фрагменты ДНК (1 мкг на пробу) разделяли методом электрофореза в 0,8% агарозном геле. Перенос ДНК из геля на нейлоновые фильтры "Biodan" осуществляли по методу К. Southern [4] в течение 24 ч.

Введение радиоактивной метки в плазмидную ДНК проводили методом нуклеотидного замещения с помощью ДНК-полимеразы Е. coli. Гибридизацию проводили с меченной 32Р плазмидной ДНК (удельная активность 107—108 имп/мкг) в течение 18 ч при 65°С в смеси, содержащей 4 х ССР, четырехкратный раствор Денхарта, 0,5 мг (У), 0,1% ДСН, 5% раствор декстрансульфата. После гибридизации фильтры тщательно отмывали и подвергали авторадиографии в течение 5—15 дней при —70°С, используя пленку РМ1 и усиливающие экраны.

Ранее при исследовании экспрессии гена ТГ при узловом эутиреоидном, диффузном токсическом и врожденном зобах, а также при раке щитовидной железы было показано снижение количества ТГ мРНК при узловом эутиреоидном и врожденном зобах. При раке щитовидной железы наблюдалось полное отсутствие ТГ мРНК. Выявленное снижение количества ТГ мРНК свидетельствовало о том, что при изученных видах тиреоидной патологии имеет место нарушение синтеза ТГ на уровне транскрипции [1].

Для того чтобы проанализировать, является ли снижение уровня ТГ мРНК результатом блокирования транскрипции гена или изменением стабильности ТГ мРНК, нами были проведены эксперименты по гибридизации ДНК, выделенной из клеток щитовидной железы при узловом эутиреоидном, диффузном токсическом зобах и при раке, с различными зондами.

Блокирование транскрипции гена ТГ при узловом эутиреоидном зобе может быть вызвано значительными перегруппировками в структуре гена ТГ в пределах кодирующей области или в пределах регуляторной фланкирующей 5-области гена.

Высокомолекулярная ДНК, выделенная из клеток щитовидной железы при диффузном токсическом, узловом эутиреоидном зобах и при раке, была обработана рестриктазами BamHI, Hindlll и гибридизована с различными зондами.

Для гибридизации использовали разные кДНК-зонды, которые покрывают 80% кодирующей ТГ области и фрагмент ДНК, близкий к 5 -области гена ТГ.

Мы исследовали возможность перегруппировок в пределах кодирующей области гена ТГ. На рис. 1 показано, что разницы в рестрикционных структурах ДНК из клеток щитовидной железы при узловом эутиреоидном и диффузном токсическом зобах нет. Эти данные ясно показывают, что значительных перегруппировок в ТГ-кодирующей области гена не обнаружено, что можно было бы отнести на счет транскрипционной реактивности этого гена при данной патологии.

Нами была исследована также возможность значительных перегруппировок в 5-фланкирующей области гена ТГ. В качестве зонда использовали фрагмент ДНК, близкий к 5-области гена. На рис. 2 видно, что разницы в рестрикционных структурах ДНК из клеток щитовидной железы при узловом эутиреоидном и диффузном токсическом зобах нет.

Таким образом, полученные данные показывают, что значительных перегруппировок в ТГ-кодирующей области и 5-фланкирующей области гена ТГ не обнаружено.

Мы исследовали возможность участия метилирования в регуляции экспрессии гена ТГ. Статус метилирования изучали в клетках щитовидной железы при раке и диффузном токсическом зобе. Была проанализирована 5-фланкирующая об-

Рис. 1. Авторадиограф образцов ДНК, обработанных рестриктазой BamHI.

Здесь и на рис. 2: / — узловой эутиреоидный зоб; 2 — диффузный токсический зоб.

ласть гена, которая содержит 2 последовательности, признаваемые рестриктазами, чувствительными к метилированию НраН и MspI, которые картируются соответственно на 680 и 1800 п. п. от исходного участка транскрипции [3].

Как показано на рис. 3, при обработке ДНК, выделенной из клеток щитовидной железы при раке, рестриктазой MspI наблюдается гиперметилирование 5-фланкирующей области гена ТГ при полном блокировании синтеза ТГ [1], т. е. между экспрессией гена ТГ и его метилированием существует обратная корреляция.

При изучении взаимосвязи экспрессии гена ТГ и его метилирования показано, что чувствительные к метилированию сайты, расположенные в

Рис. 3. Авторадиограф образцов ДНК, обработанных рестриктазой MspI.

1,4 — диффузный токсический зоб; 2 — рак щитовидной железы; 3 — узловой эутиреоидный зоб.

5-фланкирующей области гена, гиперметилируются при раке щитовидной железы, в то время как при диффузном токсическом зобе наблюдается недометилирование этих сайтов.

Участие метилирования ДНК в регуляции экспрессии гена ТГ подтверждено в работе F. Libert и G. Vassart [3]. Авторы определяли характер метилирования 5-концевой области гена ТГ человека в различных тканях. В щитовидной железе 1 из 4 НраН — MspI-сайтов найден в этой области, 3 сайта были неметилированы, тогда как в печени, слюнных железах и сперме наблюдали метилирование всех 4 сайтов. Следовательно, такое деметилирование коррелирует с экспрессией гена ТГ. Показано, что степень метилирования 5-конца гена ТГ, по-видимому, отражает активность гена во взрослых соматических тканях.

Деметилирование гена является сигналом, детерминирующим возможность его экспрессии. В целом ясно, что это относится главным образом к состоянию 5-области гена. Данные о роли недометилированности остальных частей гена пока отрывочны. Можно допустить, что изменение метилирования 5-области гена ТГ является важным, так как контролирует какие-то факторы транскрипции гена в его активации, являющиеся общими для всех генов.

При изучении взаимосвязи экспрессии гена ТГ и его метилирования показано, что чувствительные к метилированию сайты, расположенные в 5-фланкирующей области гена, гиперметилируются при раке щитовидной железы, в то время как при диффузном токсическом зобе наблюдается недометилирование этих сайтов.