Пациенты

В исследование включено 52 пациента, из них 48 с 1-ХНН, 3 с АПС-2 без 1-ХНН (у 2 — сочетание ДТЗ и СД-I, у 1 — АНТ и СД-I) и 1 пациентка с морфологически подтвержденным изолированным аутоиммунным оофоритом. Среди 48 пациентов с 1-ХНН у 6 (2 мужчины, 4 женщины; средний возраст 57,7 ± 5,1 года; длительность заболевания 18,7 ± 5,2 года) заболевание сочеталось с распро-

Таблица 2

Клиническая характеристика обследованных больных с 1-ХНН (п = 50; М ± т)

страненным органным туберкулезом, в связи с чем, вероятно, имело туберкулезный генез. У 42 пациентов 1-ХНН имела аутоиммунный генез, при этом у 23 (6 мужчин, 17 женщин; возраст 47,1 ± 2,9 года; длительность заболевания 10 ± 1,7 года) являлась единственной эндокринопатией. У 15 пациентов (3 мужчины, 12 женщин; возраст 46,8 ± 14,6 года; длительность заболевания 8,8 ± 2,4 года) 1-ХНН являлась частью АПС-2, в И случаях сочетаясь с АИТ (как правило, на стадии первичного гипотиреоза), в 2 — с ДТЗ, в 1 — с первичным гипогонадизмом и в 1 случае — одновременно с АИТ и СД-I. У 4 человек 1-ХНН являлась частью АПС-1 (все женщины; возраст 14,3 ± 2,2 года; длительность заболевания 4,5 ± 1,7 года). У 2 пациентов АПС-1 был представлен сочетанием 1-ХНН с ГПТ, слизистокожным кандидозом и алопецией; у 1 пациентки — с ГПТ, кандидозом, первичным гипогонадизмом и аутоиммунным гепатитом, еще у 1 пациентки — с ГПТ, кандидозом и АИТ. Клиническая характеристика обследованных больных представлена в табл. 2. Протокол исследования был одобрен этическим комитетом клиники эндокринологии ММА им. И. М. Сеченова.

Фрагменты комплементарной человеческой ДНК (кДНК) ферментов Р450с17 [5], Р450с21 [И] и P450scc [4] были экспрессированы в Escherichia coliс использованием плазмиды pJEX-1 по стандартному протоколу [13]. Фрагмент человеческой кДНК фермента Р450с17 [10] (811 — 1736 пар — п. о. — с кодирующей последовательностью в 753 п. о.) был лигирован в участок вектора, расщепленный рестриктазой EcoRI, с последующей экспрессией последних 242 аминокислот (АК) фермента Р450с17 с мол. массой 31 кД при электрофорезе в натрийдодецилсульфат-полиакриламидном геле.

Состоящая из 1236 п. о. кДНК фермента Р450с21 была расщеплена с помощью рестриктазы EcoRI, липкие концы были заполнены фрагментом Кленова, а затем отщеплены рестриктазой TaqI. Фрагмент ДНК в 980 п. о. от 3-конца (с кодирующей последовательностью в 690 п. о.) был лигирован в плазмиду pJEX-1 с помощью рестриктаз EcoRV и Accl. Экспрессированный продукт, состоящий из 230 карбокситерминальных АК фермента Р450с21, имел мол. массу ЗОкД.

Целая кДНК фермента P450scc, состоящая из 1821 п. о., была расщеплена с помощью рестриктазы Styl, липкие концы были заполнены фрагментом Кленова, после чего к ней был присоединен 8-членный Ncol-линкер. Затем кДНК была расщеплена с помощью рестриктаз Ncol и PvuII, после чего фрагмент, состоящий из 1110 п. о., был клонирован в плазмиду, расщепленную Ncol и EcoRV. Рекомбинантный белок (43 кД) состоял из 370 АК фермента P450scc. Уровень экспрессии полноцепочечных ферментов P450scc и Р450с21 оказался слишком низким для проведения иммуноблоттинга.

Все полученные конструкты были верифицированы с помощью дидезоксисеквенирования согласно руководству по секвенированию Sequenase versin 2,0 (US Biochemicals, Cleveland, ОН). Рекомбинантные кДНК были экспрессированы в Е. coli, штамм JM-109 (DE-3) на протяжении 3 ч после индукции в 1 ммоль/л изопропил-Р-Э-тиогалактопиранозиде в присутствии 0,3% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина.

Рекомбинантные белки Р450с17, P450scc и Р450с21 разделяли в полиакриламидном геле и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (ВА85, ’’Schleicher and Schiill", Dassel, ФРГ) электрофоретически. Полученные таким образом блотты блокировали белками обезжиренного молока (5%), приготовленными в трис-НС1-буферном растворе (10 ммоль; pH 7,6), содержащем 150 ммоль NaCl. В дальнейшем блотты инкубировали с сыворотками пациентов и контрольными сыворотками, разведенными в блокирующем растворе от 1 : 30 до 1 : 100, в течение 10—12 ч. Затем мембраны отмывали и последовательно инкубировали с биотинилированными антителами к IgG человека (1 : 500) и авидином D, конъюгированным с ферментом пероксидазы хрена (1 : 1000) ("Vector Laboratories"; Inc. Burlingame, США). Перед проявлением блотты отмывали трис-НС1-буферным раствором (pH 7,4) и визуализировали в цветной реакции, используя перекись водорода и 4-хлор-1-нафтол в качестве субстрата и хромогена соответственно.

Частота обнаружения антител к ферментам надпочечникового стероидогенеза при 1-ХНН аутоиммунного генеза и АПС

Статистическую обработку материала проводили с помощью стандартных методов. Значения в тексте и в таблицах представлены как М ± т (Р ± тр\ где т — ошибка презентативности показателей. Достоверность различий между данными подсчитана с помощью /-коэффициента Стьюдента; р < 0,05 рассматривали как достоверный критерий различий.

Этиологическая диагностика 1-ХНН в клинической практике часто представляет серьезные трудности. На протяжении многих десятилетий диагноз 1-ХНН ставили на основании отсутствия у пациента туберкулеза легких и других органов. С открытием специфических серологических маркеров аутоиммунной 1-ХНН, которыми являются антитела к ферментам надпочечникового стероидогенеза Р450с21, Р450с17 и P450scc, возможности этиологической диагностики существенно расширились. В настоящей работе гомологичные антитела с помощью иммуноблоттинга не были обнаружены ни

Рис. 1. Соотношение частоты обнаружения антител к Р450с21, Р450с17 и P450scc у пациентов с изолированной 1-ХНН (я; п = 23), АПС-2 (б; п = 15) и АПС-1 (<?; п = 4).

Цифра внутри окружности обозначает число пациентов с выявленными антителами к ферменту, обозначенному сверху. Если цифра находится сразу в двух окружностях, у такого числа пациентов выявлено сразу 2 типа антител; если в трех окружностях — 3 типа антител.

Рис. 2. Иммуноблоттограммы рекомбинантных ферментов Р450с 17 и P450scc с сыворотками пациентов с АПС-1, а также положительными контролями.

1 и 2 — положительные контроли; 3—5 — сыворотки пациентов. Наличие антител в сыворотке определяется по окрашиванию в зонах, соответствующих молекулярным массам рекомбинантных ферментов Р450с17 (31 кД) и P450scc (43 кД).

у одного из 6 пациентов, у которых в связи с наличием обширного туберкулезного процесса исходно предполагался туберкулезный генез 1-ХНН, а также у 3 пациентов, имевших АПС-2 без 1-ХНН. Антител также не выявлено у пациентки с изолированным морфологически подтвержденным аутоиммунным оофоритом.

Данные о частоте выявления антител с Р450с21, Р450с17, P450scc у пациентов с 1-ХНН аутоиммунного генеза представлены в табл. 3. У пациентов с изолированной 1-ХНН наиболее часто (74%) определяются антитела к Р450с21; с еще большей частотой они выявляются у пациентов с 1-ХНН в рамках АПС-2 (80%) и в небольшой группе больных с АПС-1 (75%). У всех пациентов первых двух групп, у которых определялись антитела к Р450с17 или P450scc, одновременно были обнаружены антитела к Р450с21; антител одновременно ко всем трем ферментам ни у одного из пациентов этих групп не выявлено (рис. 1, а, б).

Антитела к неспецифичным для коры надпочечников Р450с17, P450scc оказались более специфичными для АПС-1. На рис. 2 показаны иммуноблоттограммы рекомбинантных ферментов Р450с17 и P450scc с сыворотками пациентов с АПС-1, а также положительными контролями [10, 16]. У всех 4 пациентов с АПС-1 обнаружены антитела хотя бы к одному из ферментов, у 1 пациентки — только к P450scc, а у 2 больных — сразу ко всем трем ферментам см. (рис. 1, в). Таким образом, антитела к Р450с17 и P450scc могут использоваться в качестве серологических маркеров АПС-1 у детей с изолированным слизисто-кожным кандидозом, ГПТ, СД-I и 1-ХНН.

Результаты проведенных исследований в очередной раз свидетельствуют о высокой диагностической ценности определения антител к Р450с21 как маркеров аутоиммунной деструкции коры надпочечников в дифференциальной диагностике между 1-ХНН туберкулезного и аутоиммунного генеза. На рис. 3 представлен пример иммуноблоттинга с рекомбинантным ферментом Р450с21. При совместном рассмотрении групп с изолированной аутоиммунной 1-ХНН и АПС-2 (38 пациентов) выяснилось, что в подгруппе с длительностью 1-ХПП менее 15 лет антитела к Р450с21 были выявлены в 86,2 ± 6,4% случаев, а с длительностью 1-ХНН 15 лет и более — в 44,4 ± 16,56%; разница достоверна (/ = 2,35; р < 0,05). Таким образом, при клинической интерпретации наличия или отсутствия у пациента антител к Р450с21 необходимо учитывать длительность заболевания. Изменение частоты обнаружения антител к Р450с21 по мере увеличения длительности 1-ХНН представлено на рис. 4.

В клинической практике достаточно часто встречаются случаи: когда у пациентов с 1-ХНН при постановке диагноза рентгенографически в легких выявляются мелкие петрификаты. Если у здорового человека или пациента с другой патологией этой находке, как правило, не придают серьезного значения, то у пациентов с 1-ХНН ее часто расценивают как прямое указание на туберкулезный генез 1-ХНН. Одна из наших пациенток в свя-

Рис. 3. Иммуноблоттограммы рекомбинантного фермента Р450с21 (мол. масса 30 кД).

Полосы 1 и 2 — блотты с положительными контролями; 3 и 4 — с сыворотками пациентов с 1-ХНН туберкулезного генеза; 5—8 — пациенты с изолированной 1-ХНН аутоиммунного генеза; 9—11 — пациенты с 1-ХНН в рамках АПС-2.

----------------------------- 1------------------------------ 1------------------------------- 1________________

<7 лет 7-14 лет 12-21 год >21 года

80

60

40

20

О

Рис. 4. Частота выявления антител к Р450с21 в зависимости от длительности заболевания у пациентов с изолированной 1-ХНН и 1-ХНН в рамках АПС-2 (л = 38).

По оси ординат — частота выявления антител к Р450с21 (в %); по оси абсцисс — длительность 1-ХНН.

зи с установленным таким образом диагнозом туберкулеза надпочечников на протяжении многих лет получала профилактические курсы туреркулостатиков, несмотря на то что через 3 года 1-ХНН у пациентки манифестировал АИТ: сочетание с которым с высокой вероятностью свидетельствует об аутоиммунном генезе 1-ХНН. Мы сразу отнесли эту пациентку в группу АПС-2; с помощью иммуноблотгинга у нее были обнаружены антитела к Р450с21.

Как было показано в одной их наших прошлых работ [2], в последние десятилетия отмечается четкая тенденция к увеличению встречаемости 1 -ХНН в рамках АПС. В первую очередь речь идет об АПС-2 — полигенной мультифакториальной патологии в отличие от АПС-1 — аутосомно-рецессивного заболевания, распространенность которого определяется частотой гетерозиготного носительства патологического гена в той или иной популяции.

Принципиальное клиническое значение изучения АПС заключается в возможности прогнозирования развития АПС (второго аутоиммунного эндокринного заболевания) при наличии его изолированных компонентов. В случае АПС-1 задача облечается тем, что для этого синдрома известны генетические маркеры, а также тем, что при АПС-1 достаточно специфично определяются антитела к Р450с17 и P450scc.

Каких-либо иммуногенетических различий между изолированными эндокринопатиями и теми же заболеваниями, встречающимися в рамках АПС-2, на сегодняшний день не обнаружено. Так, в нашем исследовании частота выявления антител к ферментам стероидогенеза при изолированной 1-ХНН и при 1-ХНН в рамках АПС-2 различается незначительно. Решение проблемы ранней диагностики АПС-2 и входящих в него заболеваний во многом затруднено существенными сложностями изучения генетических основ полигенной патологии.