Макрососудистые нарушения значительно чаще встречаются у более тяжелых больных сахарным диабетом, однако специфические механизмы их развития изучены недостаточно [13].

При сахарном диабете повышение внутриклеточного уровня глюкозы в тканях, независимых от инсулина, сопровождается метаболическими изменениями, играющими важную роль в патогенезе сосудистых нарушений [1, 2]. В частности, предполагается, что активация полиольного пути и угнетение метаболизма миоинозитола наряду с усилением неферментативного гликозилирования белков являются определяющими в механизмах формирования диабетической ангиопатии [1, 11]. Эритроциты относят к инсулинрезистентным тканям, в которых при сахарном диабете создаются условия для повышения содержания глюкозы, сорбитола и фруктозы, снижения уровня миоинозитола, АТФ. глутатиона, активности мембраносвязанных ферментов, в том числе Na+, К+- АТФазы [18] Активность Na+, К+-АТФазы во многом зависит от функционального состояния фосфатдилинозитольного пути, тесно сопряженного с активностью протеинкиназы С [ 111.

Учитывая важность мембраносвязанной протеинкиназы С в поддержании необходимой кон-

Протеинкиназная и АТФазная активность мембран эритроцитов при сахарном диабете и диабетической активности

Примечание. Активность протеинкиназы С выражали в пмоль 32Р на 1 мг белка за 1 мин, активность АТФаз — в мкмоль-Фн на 1 мг белка за 1 ч. р — сравнение показателей у больных и лиц контрольной группы, р\ — у больных с микро- или генерализованной ангиопатией и без нее, р2 — у больных с I и II типами сахарного диабета без выявленных сосудистых нарушений, р3 — у больных с микро- и генерализованной ангиопатией, р4 — у больных с I и II типами сахарного диабета с микроангиопатией, ps — у больных с I и II типами сахарного диабета с генерализованной ангиопатией.

центрации ионизированного кальция в цитоплазме эритроцитов и, таким образом, в регуляции различных внутриклеточных процессов, ее возможную роль в регуляции Na ,К+-АТФазы, мы изучали активность этих ферментов при сахарном диабете, диабетических макро- и микрососудистых нарушениях в сравнении с аналогичными показателями при атеросклерозе.

Материалы и методы

Под наблюдением находилось 76 больных (35 женщин, 41 мужчина) в возрасте от 17 до 72 лет, страдающих сахарным диабетом (I тип — у 30, II тип — у 46). Длительность заболевания составила от 1 мес до 15 лет. Параллельно обследовано 17 больных, страдающих атеросклерозом с преимущественным поражением сосудов нижних конечностей и неизмененными показателями теста толерантности к глюкозе. Контрольную группу составили 22 практически здоровых человека в возрасте от 19 до 69 лет. Характер и степень диабетической ангиопатии определялись согласно классификации А. С. Ефимова [I].

Тени эритроцитов получали по методу 110]. Для этого венозную кровь собирали в гепаринизированные пробирки и помещали на лед. Образцы крови центрифугировали при 1000 g в течение 15 мин при 4 °C. Эритроциты трижды промывали в тех же условиях центрифугирования раствором, содержащим 150 мМ NaCl в 5 мМ Na-фосфатном буфере (pH 8,0). Затем эритроциты гемолизировали в 15-кратном объеме 5 мМ Na-фосфатного буфера (pH 8,0) и осаждали при 30 000 g в течение 20 мин. Осадок трижды промывали средой гемолиза. Полученную фракцию мембран доводили средой промывки до объема, равного исходному объему эритроцитов.

Активность мембраносвязанной протеинкиназы С определяли в инкубационной среде (0,2 мл), содержащей 20 мМ трис-НС1-буфер (pH 7,0), 5 мМ MgCl2, 0,2 мМ СаС1г, 10 мМ NaF, 50 мкМ [у-32Р] АТФ (1О'° Бк/мкмоль), 0,1 мкг/мл 4р-форбол-12р-миристат-13а-ацетата (ФМА) и 0,05 % тритон X-100. Реакцию инициировали добавлением АТФ и проводили в течение 1 мин при 30 °C, останавливали добавлением 2 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты. Пробы наносили на мембранные фильтры («Millipore», диаметр пор 0,45 мкм) и радиоактивность их определяли при помощи сцинтилляционного счетчика «Beckman LS-7000». Активность протеинкиназы С изучали параллельно в мембранах эритроцитов в отсутствие и присутствии ФМА, который, как и 1,2-диацилглицерин, является активатором данного фермента [8]. Об активности протеинкиназы С судили по разности между включением 32Р в белки мембран в присутствии форболового эфира и в его отсутствие 115].

Активность АТФаз определяли согласно [7], а концентрацию белка — по методу Лоури [14].

Результаты и их обсуждение

Как видно из таблицы, базальная протеинкиназная активность является наименьшей (74,1± ±5,26 пмоль 32Р на 1 мг белка в 1 мин) в мембранах эритроцитов лиц контрольной группы. При различных формах сахарного диабета она возрастает на 7,6—17,4 %. Активность фермента, активируемого форболовым эфиром, т. е. активность самой протеинкиназы С, наибольшая (37,3± ±5,82 пмоль 32Р на 1 мг белка в 1 мин) в плазматических мембранах эритроцитов лиц контрольной группы. При инсулинзависимом сахарном диабете у больных без сосудистых нарушений активность протеинкиназы С уменьшается на 47 %, а при наличии диабетической ангиопатии — на 94 %. У больных диабетом II типа без сосудистых нарушений активность протеинкиназы С снижается на 51 %, при диабетической микроангиопатии 1—2-й степени — на 88,7 %, при генерализованной макро- и микроангиопатии — на 95 % по отношению к контролю. У больных атеросклерозом столь значительное угнетение активности протеинкиназы С не наблюдается, она уменьшается на 20 %.

В мембранах эритроцитов больных сахарным диабетом I типа активность общей АТФазы снижается, что более выражено при диабетической ангиопатии (р<0,001). Прогрессирование сосудистых нарушений при инсулиннезависимом сахарном диабете сопровождается некоторым повышением активности общей АТФазы. В тенях эритроцитов больных сахарным диабетом I типа и генерализованной ангиопатией активность Mg2+- зависимой АТФазы составила 0,25± ±0,024 мкмоль-Фн на 1 мг белка за 1 ч, у больных со II типом — 0,69±0,045 мкмоль Ф„ на 1 мг белка за 1 ч (р<0,001). Значительное угнетение \а + ,К+-зависимой АТФазы наблюдается при прогрессировании диабетической ангиопатии, а также у больных атеросклерозом.

Активность Na + ,К. -АТФазы составляет основу функционирования Na+,K+-Hacoca и играет решающую роль в поддержании концентрационных градиентов Na+ и К+ между цитоплазмой и внеклеточной средой. Ингибирование \а + ,К+-АТФ- азы, а также Са2+-АТФазы показано в мембранах эритроцитов больных сахарным диабетом и при экспериментальном диабете [4, 6]. Результатом снижения концентрационного градиента Na+ может быть угнетение активности Ыа+/Са2+-обмен- ного механизма, функционирующего исключительно благодаря этому концентрационному градиенту [4]. Ингибирование Са2+-АТФазы с соответствующим угнетением деятельности Са2+-насоса сопровождается повышением уровня цитоплазматического кальция [6].

Длительная адаптация организма к гипоксии, которая наблюдается при сахарном диабете, сопровождается повышением соотношения НАД-Н/НАД, снижением содержания АТФ и увеличением уровня АДФ, АМФ [9]. Дефицит АТФ может способствовать снижению резистентности фосфолипидов мембран к эндогенным фосфолипазам, приводящему к изменению фосфолипидного состава мембран, повышению их проницаемости для ионов Са2+ [4, 8]. В ряде исследований показано, что при сахарном диабете уровень фосфолипидов и свободного холестерина мембран эритроцитов снижается с одновременным повышением активности фосфолипаз, играющих важную роль в повреждении липидного бислоя мембран и образовании лизофосфолипидов [5, 12]. В свою очередь АДФ индуцирует аккумуляцию инозитолтрифосфата и повышение цитозольной концентрации CaL+, что было показано в эндотелиальных клетках аорты [8].

Угнетение активности \а + ,К+-АТФазы приводит к множественным биохимическим, Na-зависи- мым процессам нарушения транспорта субстратов и метаболитов через клеточную мембрану и, в частности, поступления миоинозитола [11]. Угнетение активности \а+,К+-АТФазы и натрий-калиевого насоса с одновременным снижением уровня миоинозитола показано в различных тканях при сахарном диабете [12]. Миоинозитол является предшественником в синтезе инозитолсодержащих фосфолипидов, гидролиз которых опосредуется действием инозитол-1,4,5-трифосфата и 1,2- диацилглицерина, вторичных мессенджеров, принимающих участие в высвобождении кальция из внутриклеточных депо, а также в активировании протеинкиназы С [8, 15]. Активаторы протеинкиназы С способствуют нормализации оубаинзави- симого поглощения кислорода в нервной ткани при экспериментальном сахарном диабете, а также в эмбриональных фибробластах мышей, что может указывать на участие протеинкиназы С в регуляции активности \а+,К+-АТФазы [16]. Подтверждением этому является возможность фосфорилирования \а+,К+-АТФазы мембраносвязанной, не зависимой от цАМФ, протеинкиназой [17]. В нервной ткани при сахарном диабете фосфорилирование белков, зависимое от протеинкиназы С, уменьшается, что объясняется снижением количества субстрата [11]. Результаты этих исследований позволили предположить, что нарушение метаболизма фосфоинозитола в инсулинрезистент- ных тканях при сахарном диабете является результатом снижения уровня миоинозитола, что приводит к угнетению эффектов 1,2-диацилглицерина и/или инозитол-1,4,5-трифосфата, протеинкиназы С и может способствовать снижению активности Ыа+,К+-АТФазы через механизмы фосфорилирования [12].

Повышенная проницаемость мембран эритроцитов для Na + ,K+ и Са2+ рассматривается в качестве одной из основных причин развития гипертонической болезни, ишемических повреждений сердца [3, 4]. Установленное нами угнетение активности На + ,К+-АТФазы и протеинкиназы С в мембранах эритроцитов больных атеросклерозом свидетельствует в пользу этого предположения.

При сахарном диабете и особенно при прогрессировании сосудистых нарушений снижение активности протеинкиназы С значительно более выражено, что может служить подтверждением роли нарушений метаболизма фосфоинозитола, функционального состояния протеинкиназы С в патогенезе диабетической ангиопатии.

Выводы