Хорошо известно, что сахарный диабет является полигормональным заболеванием. В его патогенезе инсулину хотя и принадлежит главенствующая роль, однако принимают важное участие в его развитии и течении и другие гормоны. В первую очередь это относится к глюкагону и соматостатину [8]. Эти гормоны синтезируются в А- и D-клетках островков Лангерганса и вместе с инсулинпродуцирующими В-клетками образуют единый эндокринный комплекс, участвующий в регуляции углеводного гомеостаза [10, 11]. Применяемые в настоящее время большинством исследователей способы оценки состояния эндокринной функции поджелудочной железы базируются на радиоиммунологических методах определения в крови инсулина, С-пептида, глюкагона и соматостатина. Однако концентрация гормона в крови зависит от многих факторов, таких, как, секреторная активность эндокринных клеток, фазы секреции (накопление или выведение), процесс инактивации, взаимодействие с рецепторами, возможность выработки гормонов другими эндокринными клетками. Поэтому адекватно оценить состояние секреторной функции эндокринных клеток можно только комплексно, определяя концентрацию соответствующего гормона в крови (радиоиммунологическим методом) и его содержание в А-, В- и D-клетках (иммуноцитохимическим методом). С учетом изложенного выше, целью настоящего исследования было комплексное изучение состояния эндокринного аппарата поджелудочной железы при экспериментальном сахарном диабете, адаптации к гипоксии и их сочетании, что позволило бы выявить особенности взаимоотношений А-, В- и D-клеток в различных условиях. Материалы и методы Исследование ' проведено на 80 крысах линии Вистар обоего пола массой 200-230 г, находившихся на стандартном пищевом рационе в одинаковых условиях. Все животные были разделены на 4 экспериментальные группы: 1- я - интактные животные; 2-я - животные с сахарным диабетом; 3-я - животные, подвергавшиеся адаптации к гипоксии в течение 21 дня; 4-я - животные с сахарным диабетом, которые с 16-го дня моделирования заболевания подвергались адаптации к гипоксии. В каждой экспериментальной группе было по 10 животных. Радиоиммуно- логические и иммуноцитохимические исследования проводились на одних и тех же животных. Сахарный диабет (легкое течение) [1] моделировали при помощи внутрибрюшинного введения 50 мг/кг стрептозото- цина [12]. Адаптация к гипоксии осуществлялась путем ежедневного помещения животных в вентилируемую барокамеру на 6 ч, в которой разрежение воздуха соответствовало в 1-й день I км, во 2-й день - 2 км, в 3-й день - Таблица I Концентрация глюкозы и гормонов поджелудочной железы в периферической крови крыс (Af±m) Серия экспериментов Глюкоза, ммоль/л Инсулин, мкЕД/мл Глюкагон, пг/мл Соматостатин, пг/мл Контроль 4,62±0,24 34,7±3,6 67,8±3,8 18,5±1,5 4,90±0,11 31,5±4,9 75,8±14,3 - Диабет (16 дней) 6,36±0,34** 15,4±4,2‘* 66,8±9,9 19,5±1,9 6,09±0,52** 13,8±3,7** 122,4±21,3 - Диабет (37 дней) 8,78±0,59** 11,4±3,8’* 90,6±7,6* 24,4±2,1** 7,59±0,88** 12,3±1,1“ 150,2±22,3** - Адаптация к гипоксии (21 день) 3,52±0,29** 32,6±6,2 105,6±10,4** 38,3±5,2** 4,00±0,17** 30,4±4,7 93,8±8,9 - Диабет с последующей адаптацией к гипоксии 7,59±0,46** 30,4±4,1 88,4±7,2* 41,3±8,4** 6,06±0,56 26,4±2,3 131,6±24,9 Примечание. Концентрация в крови соматостатина у самок не определялась. Одна звездочка - р<0,05, две - р<0,01. Здесь и в табл. 2 в числителе - содержание у самцов, в знаменателе - у самок. 3 км, в 4-й день - 4 км, в 5-й день - 5 км, в 6-й день и далее до 21 дня - 6 км [4]. В 4-й группе животные начиная с 16-го дня моделирования заболевания подвергались адаптации к гипоксии по указанной выше схеме в течение 21 дня. Животных забивали для взятия крови и поджелудочных желез по общепринятым правилам в одно и то же время суток после 16-часового голодания; во 2-й группе - на 16-й и 37-й дни, в 3-й - на 22-й день, в 4-й на 37-й день. Концентрацию гормонов в крови определяли радиоиммунологическим методом при помощи стандартных наборов для определения инсулина (РИО-ИНС-1-М, СССР), глюкагона (BIODATA, Италия), соматостатина (INSTAR, США). Количественное иммуноцитохимическое определение инсулина в В-клетках, глюкагона - в А-клетках, соматостатина - в D-клетках проводилось методом непрямой иммунофлюоресценции при помощи наборов фирмы «Amer- sham» (Англия). В качестве первичных антител служили моноклональные антитела к инсулину и кроличьи антисыворотки к глюкагону и соматостатину, вторичными были кроличьи антитела к IgG мыши и крысиные к IgG кролика, конъюгированные с FITC. Выявление гормонов в клетках проводилось на серийных срезах толщиной 4 мкм, взятых в различных отделах поджелудочной железы. Срезы, заключенные в смесь, состоящую из фосфатного буфера и глицерина (9:1), изучались под люминесцентным микроскопом ЛЮМАМ-И2 с фотометрической насадкой ФМЭЛ-1А. Использовался объектив 40Х, зонд 0,5, длина волны 480 нм, характерная для FITC. Содержание гормонов в клетках, прямо пропорциональное интенсивности флюоресценции, выражали в условных микроединицах, получаемых путем обработки сигнала в миливольтах с цифрового вольтметра В7-16А, сопряженного с ЭВМ «Электроника ДЗ-28». В каждой группе исследовалось 200-400 клеток. Кроме того, у всех животных во всех экспериментальных группах определяли глюкозу в сыворотке крови ортотолуидиновым методом и проводился тест толерантности к глюкозе (4 г/кг внутрибрюшинно). Результаты исследований подвергались статистической обработке на ПЭВМ «ATARI 130ХЕ». Результаты и их обсуждение При введении стрептозотоцина уровень глюкозы в крови крыс постепенно нарастал (табл. 1), изменялся также тест толерантности (уровень гликемии через 2 ч после введения глюкозы был выше исходного, в то время как у интактных животных снижался). У животных с сахарным диабетом на 16-й день и еще в большей степени на 37-й день концентрация инсулина в сыворотке крови была достоверно снижена (см. табл. 1). В поджелудочной железе при иммуноцитохимическом исследовании выявлялось снижение интенсивности флюоресценции, что связано с уменьшением содержания инсулина в В-клетках (табл. 2). Кроме того, обнаруживалась деструкция части островков, что особенно четко проявлялось на 37-й день, причем в большей мере поражались крупные островки, в то время как мелкие оставались практически интактными. Более выраженное уменьшение содержания инсулина в В-клетках отмечалось у самцов (см. табл. 2). Следует указать на появление среди ацинарной ткани поджелудочной железы небольшого количества единичных В-клеток, чего не наблюдалось у интактных животных. Концентрация глюкагона в плазме достоверно увеличивалась, особенно к концу исследования. В А-клетках на 16-й день содержание глюкагона у самок было также, как и в плазме, увеличено, в то время как у самцов оно было достоверно снижено, что, по-видимому, связано либо с процессом интенсивного выведения гормона в кровь, либо с угнетающим влиянием на его секрецию соматостатина. На 37-й день содержание глюкагона значительно возрастало и у самцов, и у самок, но в большей степени у самцов, при этом А-клетки были гипертрофированы. Концентрация соматостатина в плазме крови также постепенно увеличивалась, достигая достоверных различий по сравнению с контролем толь- Таблица 2 Содержание гормонов (в усл. мкЕД) в клетках поджелудочной железы крыс (Af+m) Серия Гормоны инсулин глюкагон соматостатин Контроль 1560,7±21,5 1284,4±1 1,5 789,6±19,3 1585,7 ±16,7 1194,2±12,1 700.6± 12,1 Диабет 727,9± 16,2*** 1057,1 ± 11,8*** 1068,9±17,1*** (16 дней) 879,2± 16,5*** 1282,4^14,7*** 979,5± 16,8*** Диабет 618,7± 16,8*** 1485,1 ± 13,3*** 1075,0±20,6*** (37 дней) 758,5±12,9*** 1398,4± 11.6*** 1135,0± 19,3*** Адаптация к ги- 1648,3±27,6** 1141,2± 12.3** 722.9±12.7** поксии (21 день) 1670,1 ± 17.7*** 1089,9± 14.7*** 691.9 ±18,8 Диабет с после- 1298,4± 11,2*** 1326,4 ±15,2* 792,2± 17,4 дующей адаптацией к ги- 1259,8±9,8‘** 1301,2±14,9*** 767.1±15.4** поксии Примечание. Одна звездочка - р<0.005, две - р<0.01. три - р< <0,001. ко на 37-й день. В отличие от плазмы, содержание соматостатина в D-клетках значительно увеличивалось уже на 16-й день и в дальнейшем у самцов не изменялось, а у самок продолжало нарастать. Таким образом, увеличение содержания соматостатина в D-клетках не сопровождалось его адекватным увеличением в периферической крови. Следует также отметить, что D-клетки в этих условиях увеличивались в размерах и все больше напоминали по строению нейроны с отростками, содержащими гормон. В 111 серии экспериментов адаптация животных к гипоксии на протяжении 21 дня приводила к развитию умеренной гипогликемии. Концентрация инсулина в сыворотке крови находилась на уровне контроля. Содержание инсулина в В-клетках было достоверно выше, чем у интактных животных. Кроме того, в срезах поджелудочной железы обнаруживалось большое количество единичных клеток, дающих реакцию с моноклональными антителами к инсулину. Эти данные свидетельствуют о том, что в условиях гипоксических тренировок возрастает синтетическая активность В-клеток, а также появляются новые инсулино- циты, происходящие, возможно, либо из эпителия выводных протоков [2, 6], либо из так называемых ациноостровковых. Содержание глюкагона в плазме крови было увеличено, а в А-клетках - достоверно снижено, что, по-видимому, связано с усиленным выведением гормона в ответ на развивающуюся гипогликемию [5]. Концентрация соматостатина в плазме в этих условиях была значительно увеличена, в то время как его содержание в D-клетках у самцов было достоверно снижено, а у самок оставалось на уровне контроля. Гипоксические тренировки у животных с сахарным диабетом приводили к некоторому снижению уровня гликемии и нормализации теста толерантности к глюкозе. Концентрация инсулина в сыворотке практически достигала уровня контроля. В поджелудочной железе отмечалось уменьшение количества островков с признаками деструкции, а содержание инсулина в В-клетках значительно возрастало по сравнению с животными 2-й группы (на 37-й день), которые не подвергались гипоксической тренировке, составляя около 80 % от уровня контроля. Концентрация глюкагона в крови и его содержание в А-клетках снижались по сравнению с таковыми у животных с диабетом, но все же оставались выше, чем у интактных животных. Содержание соматостатина в D-клетках также значительно снижалось, однако его концентрация в крови оставалась на довольно высоком уровне. Таким образом, проведенные исследования показали, что адекватная оценка состояния эндокринной функции поджелудочной железы возможна лишь при использовании комплекса методик - иммуноцитохимических и радиоиммуноло- гических. Кроме того, из приведенных выше данных следует, что развитие начальных стадий сахарного диабета сопровождается перестройкой всей эндокринной части поджелудочной железы. В ответ на резкое снижение содержания инсулина компенсаторно активируется глюкагоновая секреция с целью адекватного обеспечения тканей глюкозой, а также стимуляции оставшихся неповрежденными В-клеток (9, 10]. Роль же соматостатина при этом не столь однозначна, так как этот гормон, обладая широким спектром действия [7], может давать различный, иногда даже противоположный эффект. Так, известно, что соматостатин, вырабатывающийся в D-клетках поджелудочной железы, может угнетать активность А- и В-клеток, а соматостатин, вырабатывающийся в гипоталамусе, может угнетать выработку соматотропного гормона, являющегося диабетогенным фактором [3]. В проведенных нами исследованиях, результаты которых предполагается рассмотреть в отдельной статье, обнаружены признаки гипертрофии соматостатин- продуцирующих нейронов гипоталамуса, расположенных в аркуатном и перивентрикулярных ядрах, а также значительные изменения концентрации иммунореактивного соматостатина в наружной зоне срединного возвышения гипоталамуса. Результаты проведенных исследований показали положительное влияние адаптации к гипоксии на состояние поджелудочной железы у животных с диабетом. Механизм этого влияния довольно сложен и многообразен, но исходя из полученных данных можно представить несколько его звеньев. Это прежде всего стимуляция биосинтеза инсулина в В-клетках, торможение процесса их деструкции, появление новых инсулино- цитов. Важную роль играет, по-видимому, также снижение активности А- и D-клеток, что приводит к уменьшению уровня гликемии и повышению активности В-клеток. Известно, что адекватная реакция А-клеток зависит от состояния В-клеток (9]. По-видимому, стимуляция биосинтеза инсулина в условиях адаптации к гипоксии приводит к нормализации реакции А-клеток на гипергликемию, которая нарушается при диабете [9]. Кроме того, показано, что течение сахарного диабета и изменения со стороны поджелудочной железы имеют особенности в зависимости от пола животных. Выводы 1. Комплексное изучение эндокринной функции поджелудочной железы показало, что развитие сахарного диабета связано с перестройкой всех компонентов островков Лангерганса и имеет свои особенности в зависимости от пола животных. 2. Адаптация к гипоксии оказывает положительное влияние на развитие экспериментального сахарного диабета у крыс.