Сахарный диабет (СД) вызывает ряд серьезных поражений сердечно-сосудистой системы, в том числе различного рода ангиопатии, сопровождающиеся резкими нарушениями процессов тромбообразования, тонуса сосудов, циркуляции крови в тканях [5, 9]. Именно они - главная причина, приводящая больных СД к инвалидности и летальным исходам. Важную роль в регуляции сосудистого тонуса и функциональной активности тромбоцитов (их агрегации) играют простаноиды, в особенности простациклин (ПГ12) и тромбоксан (ТхА2). Активация же перекисного окисления липидов (ПОЛ), имеющая место при СД [18], может существенно влиять на биосинтез указанных соединений через образование их предшественников - простагландин (ПГ)-эндоперекиси, модификацию активности ПГ-синтезирующих ферментов в целом [12, 13]. В нормально функционирующей клетке существует, как известно, система антиоксидантной защиты, активность которой при различных патологических состояниях снижается, способствуя усилению ПОЛ. Одним из естественных антиоксидантов в организме является а-токоферол - а-Т (витамин Е), содержание которого в тромбоцитах при СД значительно снижается [14]. С помощью антиоксидантов, в частности а-Т, можно осуществлять регуляцию процессов ПОЛ, корригируя тем самым имеющиеся при данной патологии мембранные нарушения и влияя на активность ПГ-метаболизирующих ферментов. Для эффективного блокирования процессов ПОЛ необходимо такое соединение, которое могло бы в нужной и равномерной концентрации достичь всех органов и тканей. Масляный раствор витамина Е, применяемый в медицинской практике, не может удовлетворить этим требованиям из-за невозможности его введения в кровяное русло. В связи с этим несомненный интерес представляет новая эмульсия а-Т, приготовленная на основе биосовместимых эмульгаторов, которую можно вводить внутривенно. В настоящей работе изучено влияние данной формы а-Т на развитие микроангиопатии, агрегацию тромбоцитов и функционирование системы ПГ12-ТхА2 в сосудистой стенке и тромбоцитах при СД в динамике заболевания. Материалы и методы Работа проведена на 80 крысах-самцах линии Вистар 2- месячного возраста. Воспроизведение СД. СД вызывали однократным внутрибрюшинным введением стрептозотоцина (фирмы «Sigma», США) в дозе 60 мг на 1 кг массы животного [16]. Препарат разводили в цитратном буфере (pH 4,2) непосредственно перед инъекцией в объеме 0,5 мл. Контрольным животным тем же способом вводили цитратный буфер в том же объеме. Воду и корм давали животным ad libitum в течение 6 нед. До введения стрептозотоцина и на 1, 2, 4 и 6-й неделях после его введения, а также перед забоем животных определяли содержание глюкозы в крови (ортотолуидиновым методом), содержание глюкозы, белка, азота кетонов и значение pH в свежей порции мочи с помощью стандартных полосок Medi-Test («Macherey-Nage», ФРГ). По наличию протеинурии судили о развитии нефропатии, в основе которой, как известно, лежат поражения сосудов почек - диабетическая ангиопатия. Введение эмульсии а-Т. Стерильную эмульсию а-Т вводили в хвостовую вену крыс в дозе 1 мг на 100 г массы животного с интервалом 48 ч в течение 6 нед. Крысы были разделены на 5 групп: 1-я - животные, которым вводили цитратный буфер; 2-я - те же условия плюс а-Т; 3- я - животные с СД; 4-я - животные с СД без ангиопатии, которым вводили а-Т; 5-я - инъекция стрептозотоцина плюс а-Т после развития диабетической нефропатии. Выделение тромбоцитов. Животных на ночь оставляли без пищи. На следующий день под легким эфирным нарко- Сопоставление соматического состояния и показателей обмена у контрольных животных и животных с СД при введении а-Т до начала (А) и в конце (Б) эксперимента (Af±m) Показатель Контроль (л=5) Контроль 4-а-Т (я=5) СД (л=8) СД+а-Т (»-7) Осложненный СД+а-Т (я- 10) Масса тела, г: А 262,0± 15,1 330,0± 15,1 280.0+22,3 315,7±28,0 266,0+14,4 Б 448,2±30,3* 438,0±28,0** 304,4±20,5 299,0±27,9 260,5±4,1 Прибавка массы тела (А, Б) 186,2±22,7 108,0±21,5 22,4±21,0 - 16,4+27,9 -6,0± 14,2 Глюкоза крови, мг/дл: А 84,9±4,9 93,2±9,1 89,4±6,1 99,3±9,7 106,6±5,0 Б 107,8±7,2** 125,8± 15,3** 324,0±21,6* 294,7± 15,5* 400,3± 17,3 Прирост содержания глюкозы (А, Б) 23,8±6,1 32,6± 12,2 234,6± 13,8 195,4± 12,6 292,0± 27,4 Выделение с мочой (Б): глюкозы, мг/дл 500 500-1000 500-1000 белка, мг/дл - - 30-100 - - кетоновых тел - - 30 % сл. 20 % сл. 10 % сл. pH мочи 6,6±0,2 6,2±0,2 6,4 ±0,1 6,1 ±0,1 6,6±0,2 Примечание. Звездочками отмечена достоверность различий показателей до начала и в конце эксперимента внутри групп: одна - р<0,001, две - р<0,05. зом производили пункцию их брюшной аорты. Кровь собирали в пластиковые пробирки с антикоагулянтом следующего состава: цитрат Na 93 мМ, лимонная кислота 7,0 мМ, D-глюкоза 140 мМ (pH 6,5) в соотношении 6:1 и центрифугировали 5 мин при 100 g. Обогащенную тромбоцитами плазму разводили антикоагулянтом в соотношении 1:1 и центрифугировали 10 мин при 350 g. Осадок ресуспенди- ровали в свежеприготовленном буфере, содержащем 150 мМ NaCI, 2,7 мМ КС1, 0,37 мМ NaH2PO4, 1 мМ MgCl2, 5 мМ D-глюкозы, 10 мМ HEPES-Na (pH 6,55), 0,35 % БСА и 0,1 мг/мл апиразы. Затем тромбоциты вновь осаждали, как описано выше, но в буфере без апиразы и при pH 7,4. Подсчет клеток осуществляли на анализаторе тромбоцитов (фирмы «Modata», Швеция). Агрегация тромбоцитов. Агрегацию тромбоцитов производили по методу G. Born и М. Cross [2], используя двухканальный агрегометр фирмы «Payton Asc> (США). Суспензию тромбоцитов (2-10® в I мл) помещали в кювету агрегометра и инкубировали в течение 1 мин при 37 °C, постоянно перемешивая (90 об/мин). Затем добавляли индуктор агрегации (АДФ) и регистрировали изменение свето- пропускания (оптической плотности) на самописце. Свето- пропускание суспензии и среды принимали соответственно за 0 и 100 % агрегации, а максимум светопропускания после добавления индуктора - за максимум агрегации. Кроме этого параметра, определяли лаг-фазу, скорость агрегации, время полумаксимальной агрегации. Содержание а-Т в тромбоцитах определяли по методу [17]. Биосинтез простаноидов из "С-арахидоновой кислоты. Биосинтез ПГ12 и ТхА2 в стенке аорты и тромбоцитах соответственно исследовали по ранее описанному нами методу 14 Результаты и их обсуждение Развитие СД характеризовалось выраженной гипергликемией, полиурией, полидипсией, глюкозурией и кетонурией. Протеинурия отмечалась у животных 3-й и 5-й групп. Введение а-Т сразу после развития СД (4-я группа крыс) предотвращало или отдаляло возникновение сосудистых осложнений (судя по отсутствию протеинурии), улучшало физическое состояние животных, но не изменяло уровня глюкозы в крови и моче. В 5-й группе крыс с СД введение а-Т на фоне развившейся нефропатии (через 6 нед после инъекции стрептозотоцина) приводило к значительному снижению протеинурии (см. таблицу). В 3-й группе животных с СД имело место значительное снижение содержания а-Т в тромбоцитах по сравнению с контрольными животными (1-я группа). При этом агрегация тромбоцитов у них была вдвое выше, чем у здоровых крыс (рис. 1). У животных с СД (3-я и 5-я группы) отмечалось существенное повышение биосинтеза ТхА2 В тромбоцитах и снижение образования ПГ12 в стенке аорты (более выраженные у животных с возникшими сосудистыми осложнениями - 5-я группа), что приводило к значительному снижению отношения ПГ12/ТхА2. Введение а-Т животным 2-й группы не влияло ни на содержание этого антиоксиданта в тромбоцитах, ни на агрегацию тромбоцитов, ни на продукцию простаноидов (см. рис. 1, рис. 2). Введение а-Т сразу после развития СД (4-я группа) приводило к повышению содержания а-Т в тромбоцитах, некоторому снижению агрегации тромбоцитов и незначительному повышению коэффициента ПГ12/ТхА2 по сравнению с животными с СД, не получавшими а-Т (3-я группа). Однако все эти показатели значительно отличались от показателей у здоровых животных (1-я группа; см. рис. 1, 2). Наибольшие изменения всех изученных показателей под влиянием а-Т имели место у крыс 5-й группы, т. е. при введении его на фоне развившихся сосудистых осложнений (см. рис. 1, 2). Антиоксидантная терапия в течение 6 нед приводила к нормализации содержания а-Т в мембранах тромбоцитов и агрегации тромбоцитов. У животных этой группы а-Т разнонаправленно изменял продукцию ПГ12 в аорте и ТхА2 в тромбоцитах: образование ПГ12 возрастало, а ТХА2 понижалось, что приводило к двукратному повышению отношения ПГ12/ТХА2 ПО сравнению с таковым у животных с СД, не получавших а-Т (3-я группа). ПГ12 и ТХА2 образуются из одних и тех же ПГ-эндоперекисных субстратов (ПГН2), которые синтезируются из арахидоновой кислоты (С20.4шб) через ряд процессов, катализируемых ПГ-эндо- пероксидсинтетазным комплексом, включающим циклооксигеназную и пероксидазную активность [3]. Арахидоновая кислота высвобождается из клеточных пулов мембранно-связанной фосфолипазой А2 [11]. Витамин Е (а-Т) может оказывать влияние как антиоксидант или регулятор образования свободных радикалов на различные этапы формирования ПГ-эндоперекисей и дальнейшую трансформацию их в простаноиды. Есть основания полагать, что направленность этого влияния и неоднородность действия а-Т на активность ПГ-синтезирующих ферментов в различных тканях зависят от интенсивности в них процессов ПОЛ [3]. Так, в наших и других [6] работах показано, что витамин Е снижает синтез ТХА2 В тромбоцитах и повышает образование ПГ12 в сосудах у животных с СД. Аналогичные сдвиги под влиянием а-Т в образовании ПГ12 и ТХА2 установлены V. Gilbert и соавт. [7] и у животных без СД при изменении содержания а-Т в диете: дефицит а-Т вызывал усиление продукции ТхА2 в тромбоцитах и снижал образование ПГ12 в сосудах, а высокое содержание а-Т в пище повышало синтез ПГ12 [4]. Считают [15], что уменьшение образования ТХА2 ПОД влиянием а-Т происходит за счет снижения активности фосфолипазы А2 и, следовательно, недостаточного образования арахидоновой кислоты для его синтеза. Это предположение подтверждается снижением содержания арахидоновой кислоты в фосфолипидах тромбоцитов у животных с СД под действием а-Т [15]. Однако наши данные свидетельствуют о влиянии а-Т и непосредственно на активность ТхА2-синтетазы, так как образование классических ПГ (ПГЕ2, nTF2, ПГО2) в тромбоцитах животных с СД под влиянием а-Т оставалось в пределах нормы. Специфическое повышение активности ТхА2-синтетазы продуктами ПОЛ отмечалось также и другими авторами. ПГ12-синтетаза, наоборот, ингибируется перекисями липидов [19]. Активация ПОЛ при СД способствует снижению продукции ПГ12 в сосудистых стенках, а а-Т как антиоксидант может стимулировать его синтез, что и имело место в наших исследованиях. Показательно, что изменение баланса ПГ12/ ТХА2 ПОД влиянием а-Т было более выраженным у животных с проявлениями микроангиопатии. Именно у этих крыс до введения а-Т имело место значительное увеличение синтеза ТхА2 и сниженное образование ПГ12, что сопровождалось повышением агрегационной способности тромбоцитов. Антиоксидантная терапия приводила к нормализации содержания а-Т в тромбоцитах и их агрегационной способности, что может быть следствием нормализации ПГ12/ТхА2 в системе тромбоцит-сосудистая стенка. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что характерная для СД активация процессов ПОЛ, связанная с нарушением клеточной антиоксидантной защиты (снижение содержания а-Т в тромбоцитах), приводит к изменению сосудисто-тромбоцитарного взаимодействия, выражающемуся в значительном повышении базальной и индуцированной агрегации тромбоцитов. Важную роль в этом процессе играет изменение отношения ПГ12/ТхА2 в сторону значительного преобладания ТхА2 с его сильным проагрегационным и сосудосуживающим действием. Особое значение в данном случае имеет тот факт, что увеличение продуктов ПОЛ вызывает, с одной стороны, торможение синтеза ПГ12, а с другой - повышение активности ТхА2-синтетазы (см. выше). Такое увеличение синтеза ТхА2 в тромбоцитах при СД наряду с нарушениями структуры сосудистой стенки, ее проницаемости и подавлением синтеза антиагрегационного, сосудорасширяющего ПГ12 может вести к нарушению микроциркуляции, образованию внутриорганных пристеночных тромбов, ишемии тканей [10]. Отсюда следует, что изменения в метаболизме арахидоновой кислоты - предшественника простаноидов в тромбоцитах и сосудистой стенке - могут иметь существенное патогенетическое значение в развитии микроангиопатии при СД. Обоснованность этого предположения подчеркивается изложенными выше данными о предотвращении возникновения и/или обратном развитии микроангиопатии при СД под действием внутривенного введения а-Т, нормализующего баланс указанных простаноидов и физиологические свойства тромбоцитов. Данное обстоятельство позволяет рекомендовать новую эмульсию а-Т в качестве лечебного и профилактического средства при диабетической и, возможно, других формах ангиопатий в клинике. Выводы 1. Развитие СД у крыс сопровождалось формированием диабетической нефропатии на фоне снижения содержания а-Т в тромбоцитах, повышения АДФ-индуцируемой агрегации тромбоцитов, нарушения функционирования системы ПП2/ТХА2 В сосудистой стенке и тромбоцитах. 2. Внутривенное введение новой эмульсии а-Т сразу после развития диабета задерживало формирование микроангиопатии, но не нормализовало полностью функциональную активность тромбоцитов и образование простаноидов в сосудисто-тромбоцитарной системе. 3. Шестинедельное введение а-Т после развития микроангиопатии приводило к обратному развитию сосудистых осложнений, нормализации содержания а-Т в тромбоцитах, их агрегации и восстановлению сосудисто-тромбоцитарного баланса ПГЦ/ТхАг.