Клинические наблюдения свидетельствуют, что в крови больных сахарным диабетом наблюдается повышенное содержание продуктов липидной пероксидации и снижение уровня восстановленного глутатиона (GSH) [1, 6]. Система глутатиона поддерживает в восстановленном состоянии поверхностные SH-группы мембранных белков, которые участвуют в стимулсекреторном сопряжении и определяют чувствительность р-клеток к действию глюкозы и других секретогенов [4]. Глутатион, весьма лабильный фактор механизма секреции инсулина, также входит в систему ан- типерекисной защиты клетки и на фоне низкого антиоксидантного потенциала р-клеток является наиболее уязвимой мишенью действия продуктов липидной пероксидации [2, 9]. Можно предполагать, что изменение тиол-дисульфидного равновесия является одним из механизмов снижения чувствительности р-клеток к действию основных секретогенов при активации перекисного окисления липидов (ПОЛ).

В связи с этим исследовались секреция инсулина и высвобождение глутатиона изолированной поджелудочной железой в условиях активации ПОЛ, вызванной инфузией прооксидантов.

Материалы и методы

Эксперименты проводились на крысах-самцах Вистар массой 280—320 г, содержавшихся на стандартной диете. Приготовление препарата изолированной поджелудочной железы проводили по методу [10]: у подвергнутого наркозу (уретан Федорова) Сибирского медицинского университета, Томск в дозе 1 г на 1 кг массы тела) животного выделяли поджелудочную железу в едином органокомплексе с участком двенадцатиперстной кишки. Изолированный препарат поджелудочной железы помещали на термостатированную платформу (37 °С) и включали в систему перфузии без рециркуляции. Афферентную и эфферентную канюли вводили в a. celia- са и v. porta соответственно и в течение 20 мин проводили уравновешивающую перфузию поджелудочной железы Кребс— Рингер-бикарбонатным буферным раствором (pH 7,35), содержащим декстран Т-40 (4%). Раствор насыщали карбогеном (95% 02 и 5% СО2). Скорость перфузии составляла 4 мл/мин при перфузионном давлении 30—35 мм рт. ст. Секрецию инсулина исследовали при концентрациях глюкозы 4,5 и 16,7 мМ. Введение реагентов в перфузирующий раствор проводили микродозатором в афферентную канюлю со скоростью 20 мкл/мин. Жизнеспособность препарата оценивали по скорости секреции инсулина в ответ на стимуляцию глюкозой и уровню сократительной активности двенадцатиперстной кишки [10]. Концентрацию инсулина в перфузате определяли радиоиммунологическим методом с применением набора рио-ИНС-ПГ-1251 с модификациями. Островки Лангерганса выделяли по методу [13] с модификациями, предложенными М. И. Пигаревой и соавт. [3]. Инкубацию островков проводили в насыщенном карбогеном Кребс—Рингер-би- карбонатном буфере с добавлением 0,1 % бычьего сывороточного альбумина (V фракция). ПОЛ активировали инфузией смеси прооксидантов: гидроперекиси трет-бутила и раствора FeSO( в конечных концентрациях 10_4 М. Содержание ТБК-активных продуктов в поджелудочной железе регистрировали по интенсивности поглощения при длине волны 535 нм [14], а в островках Лангерганса — по флюоресценции три- метинового комплекса (максимум возбуждения 515 нм, максимум флюоресценции 553 нм) [15]. Определение глутатиона в островках Лангерганса и перфузате проводили, измеряя флюоресценцию комплекса GSH и орто-фталевого альдегида при длинах волн возбуждения и флюоресценции 350 и 420 нм соответственно [12]. Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрического критерия Вилкоксона—Манна—Уитни в стандартном пакете Statgraf на IBM PC.

Рис. 1. Глюкозостимулированная секреция инсулина (в нг на 1 г ткани в 1 мин) изолированной поджелудочной железой крыс.

/—контроль; 2 — после преперфузии прооксидантами (гидроперекись трет- бутила и Fe2+, IO-4 М).

А — содержание ТБК-активных продуктов (в ед. ОД532) в поджелудочной железе через 60 мин перфузии:

/ — контроль; 2— после 20 мин преперфузии прооксидантами.

Звездочка — изменение достоверно при сравнении с контролем р<0,05. Здесь и на рис. 2: интервал а — 4,5 мМ глюкозы, интервал б — 16,7 мМ глюкозы в перфузионной среде; по оси абсцисс — время перфузии (в мин).

Результаты и их обсуждение

Перфузия препарата поджелудочной железы раствором, содержащим 4,5 мМ глюкозы, сопровождалась низким уровнем секреции инсулина — ~1 нг на 1 г ткани в 1 мин. Увеличение концентрации глюкозы до 16,7 мМ приводило к быстрому возрастанию секреции гормона до 70 нг на 1 г ткани и в 1 мин (рис. 1). При этом в процессе секреции явно выражены две фазы: быстрый выброс инсулина начинался сразу в ответ на добавление 16,7 мМ глюкозы, достигал мак- . симума через 2—3 мин; фаза медленного увеличения секреции начиналась с 10—16-й минуты, максимальная скорость (40 нг на 1 г ткани в 1 мин) отмечалась через 20—30 мин. Такая динамика секреции объясняется тем, что в первую фазу секретируется готовый инсулин, тогда как во вторую выделяется гормон, синтезированный de novo [8].

В сложном процессе секреции инсулина важную роль играют мембранные SH-группы, редокс- состояние которых тесно связано с обменом глутатиона — основного внутриклеточного тиола островков Лангерганса [4]. Скорость высвобождения изолированной поджелудочной железой GSH при концентраций глюкозы 4,5 мМ в перфузирующем растворе составляла 5 нмоль на 1 г ткани в 1 мин, а окисленного (GSSG) — около 3 нмоль на 1 г ткани в 1 мин (рис. 2,/). Повышение концентрации глюкозы до 16,7 мМ приводило к резкому выбросу GSH и GSSG, совпадавшему по времени с первой фазой секреции инсулина. Наибольшее внимание привлекает значительное увеличение скорости высвобождения GSSG в ответ на действие секретоге- на. Данные о влиянии п-хлормеркурийбензоата и дитиотриетола на глюкозоиндуцированную секрецию инсулина позволяют предположить, что при действии глюкозы на 0-клетки происходят быстрые изменения редокс-состояния мембранных тиолов [11]. Окисление SH-групп мембранных белков и их последующее восстановление глутатионом может приводить к выбросу GSSG 0-клетками. С другой стороны, высвобождение GSH поджелудочной железой и его включение в пул плазменного глутатиона также может быть одним из физиологических механизмов, поддерживающих мембранные SH-группы в восстановленном состояниии и модулирующих чувствительность 0-клеток к действию глюкозы [5]. По-видимому, соотношение скоростей выхода GSSG и GSH из 0-клеток отражает изменение редокс-состояния мембранных тиолов, вовлеченных в SH-зависимые механизмы стимулсекреторного сопряжения.

Добавление прооксидантов (гидроперекись трет-бутила и ионы Fe*+) в конечной концентрации 10-4 М приводило к активации ПОЛ, о чем свидетельствовало почти двукратное увеличение содержания ТБК-активных продуктов в поджелудочной железе (см. рис. 1). Базальная секреция инсулина в этих условиях заметно не изменялась, однако скорость глюкозостимулированной секреции значительно уменьшалась как в первую, так и во вторую фазу выделения гормона. В присутствии прооксидантов наблюдалось значительное снижение скорости выхода GSH и, как следствие, инверсия отношения GSH/GSSG (рис. 2, //). Добавление глюкозы в концентрации 16,7 мМ после преперфузии прооксидантами приводило к быстрому выбросу GSH и GSSG, однако увеличение скорости высвобождения GSSG было менее выра-

I

Рис. 2. Высвобождение GSH (/) и GSSG (2) (в нмоль на 1 г ткани в 1 мин) изолированной поджелудочной железой в ответ на добавление глюкозы (/) и после 20 мин преперфузии прооксидантами (//).

Влияние гидроперекиси трет-бутила и Fe24- (10”4 М) на содержание глутатиона и ТБК-активных продуктов в изолированных островках Лангерганса (п=10; р<0,05)

Контроль          142±26          725±80           363±42           2,0

Прооксидан

ты              553±94          573±56           597±56           0,96

жено по сравнению с изменением этого параметра в ответ на глюкозный стимул в отсутствие прооксидантов. Известно, что активация ПОЛ приводит к снижению уровня GSH и повышению уровня GSSG в клетках [7]. Нами обнаружено снижение выброса GSH перфузируемой поджелудочной железой при действии прооксидантов, указывающее на возможное уменьшение его содержания в р-клетках островков Лангерганса. Действительно, преинкубация изолированных островков Лангерганса с гидроперекисью третбутила и Fe?+ (10”4 М) приводила к активации ПОЛ, снижению содержания GSH и увеличению количества GSSG (см. таблицу). Эти изменения отражают участие системы глутатиона в восстановлении SH-групп, окисляющихся в присутствии F^+ и гидроперекисей [1, 7]. В меньшей степени, по-видимому, увеличение содержания GSSG связано с функционированием глутатионпероксидазы, активность которой довольно низка в эндокринной ткани поджелудочной железы [9]. В то же время мы не наблюдали увеличения выброса GSSG перфузируемой поджелудочной железой, что может являться следствием конкурентного ингибирования транспортной системы глутатиона смешанными дисульфидами, образование которых увеличивается при повышении концентрации GSSG [7].

Таким образом, активация ПОЛ сопровождается уменьшением содержания GSH, увеличением доли GSSG в островках Лангерганса и с течением времени может приводить к истощению пула внутриклеточного GSH и снижению редокс- потенциала SH-групп мембранных белков. Уменьшение числа мембранных SH-групп, способных включаться в механизм стимулсекреторного сопряжения, снижает чувствительность р-клеток к действию секретогена, что проявляется в подавлении стимулированной глюкозой секреции инсулина.

Выводы

При действии прооксидантов обнаружено уменьшение соотношения GSH/GSSG в изолированных островках Лангерганса и снижение скорости высвобождения GSSG и GSH перфузируемой поджелудочной железой в ответ на глюкозный стимул.