Одним из звеньев патогенеза диабетической микроангиопатии (МА) является расстройство микроциркуляции — изменение гемодинамики и гемореологии [2, 6, 7]. С нарушениями микроциркуляции тесно связано состояние тромбоцитов, которые, видимо, участвуют в возникновении и прогрессировании МА. Исследования функциональной активности тромбоцитов у больных сахарным диабетом (СД), осложненным и не осложненным МА, привели к противоречивым результатам [14], что отчасти, вероятно, обусловлено трудностями ранней диагностики ангиопатий, особенно диабетической нефропатии (ДН). Для выяснения роли тромбоцитов в патогенезе МА необходимо исследовать состояние системы тромбоцит—сосудистая стенка в ранние сроки формирования сосудистой патологии, используя для этого животных с экспериментальным СД.

Задачей нашего исследования было изучение функциональной активности тромбоцитов и антиагрегационной активности (АА) аорты в ранние сроки формирования микрососудистых повреждений в почках у крыс с экспериментальным СД.

Материалы и методы

Опыты выполнены на 64 нелинейных белых крысах-самцах массой 180—240 г, находившихся на обычном рационе питания. Инсулинзависимый СД (ИЗСД) воспроизводили введе-

Показатели тяжести заболевания и микрососудистых осложнений МД в разные сроки его течения

Примечание. ** — р < 0,01; *** — достоверность (р < 0,01) различия с СД на 15-е сутки его развития.

нием 5% раствора аллоксана подкожно в дозе 140—180 мг/кг. Тяжесть СД оценивали по уровню гликемии натощак (глюко- зооксидазным методом), глюкозурии и протеинурии (с помощью стандартных полосок "Lachema", Чехия) и по изменению массы тела. В плазме крови определяли уровень малонового диальдегида (МДА) согласно [10]. В опыт брали крыс с выраженными признаками СД через 15, 30 и 60 сут после введения аллоксана.

Агрегацию тромбоцитов исследовали в плазме крови, полученной из брюшного отдела аорты, используя в качестве индуктора Ю-5 М АДФ ("Reanal", Венгрия). Содержание МДА определяли в тромбоцитах, не активированных и активированных тромбином (2,5 ЕД/мл) [10]. АА аорты исследовали согласно [12] и оценивали по разведению инкубата аорты, снижающего в 2 раза максимальную агрегацию тромбоцитов интактных крыс.

Методом световой микроскопии исследовали почки крыс, фиксированные в 10% формалине и залитые в парафин. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и ставили PAS-реакцию. Морфометрическую оценку нефрона проводили методом точечного счета по Вайбелю. Для ультра- структурного исследования почки фиксировали в 2% растворе глутаральдегида с последующим осмированием и заливкой в эпон-812. Срезы готовили на ультратоме УМТП-3 и просматривали в микроскопе "Hitachi-300".

Результаты и их обсуждение

Характеристика СД в динамике течения заболевания представлена в таблице. У животных выявлен диабет средней тяжести, который сопровождался изменениями почечных клубочков, отмеченными на 15-е сутки заболевания и неуклонно прогрессировавшими к 60-м суткам.

Исследование агрегации тромбоцитов не выявило значимых изменений ее на 15-е и 30-е сутки развития СД, однако на 60-е сутки агрегация тромбоцитов увеличилась на 25% по сравнению с показателями в контроле (рис. 1). Одновременно прослеживалось замедление дезагрегации тромбоцитов у 30% крыс с СД, наиболее выраженное на 60-е сутки его течения.

%

zoo

760

120

во

' 20

О

12                                           3

Рис. 1. Агрегация тромбоцитов, содержание в них МДА и АА аорты у крыс в динамике течения СД (показатели в контроле приняты за 100%).

1, 2, 3 — соответственно 15, 30, 60-е сутки развития СД. а — агрегация тромбоцитов; б — МДА в неактивированных тромбоцитах; в — АА инкубата аорты.

В механизме сосудисто-тромбоцитарного взаимодействия большое значение имеют метаболиты арахидоновой кислоты (АК) — простаноиды, обладающие высокой физиологической активностью и оказывающие реципрокное действие в отношении тонуса сосудов и агрегации тромбоцитов. Мы исследовали содержание в тромбоцитах МДА, конечного продукта метаболизма АК, образующегося в эквимолярных количествах с тромбоксаном А2 и отражающего синтез последнего [11]. Содержание МДА в неактивированных и активированных тромбоцитах у крыс с СД на 15-е сутки составило соответственно 2,35 ± 0,26 и 4,87 ± 0,39 нмоль/109 клеток (р < 0,01), а на 30-е сутки — 2,04 ± 0,26 и 4,57 ± 0,61 нмоль/109 клеток (в контроле — соответственно 1,20 ± 0,13 и 2,77 ± 0,25 нмоль/109 клеток). На 60-е сутки уровень МДА в неактивированных и активированных тромбоцитах приближался к контрольным значениям (см. рис. 1). Эти данные указывают на повышение образования МДА тромбоцитами крыс с СД как in vivo, так и in vitro.

Исследование АА аортального инкубата на 15-е сутки СД выявило снижение ее по сравнению с контролем. Она продолжала нарастать, и на 60-е сутки АА аорты была в 2 раза ниже, чем в соответствующей контрольной группе.

Морфометрический анализ показал, что во все исследуемые сроки СД наблюдается рост удельного объема мезангия, в котором накапливалось РА8(+)-вещество. Отмечалась гиалиново-капельная и зернистая дистрофия эпителия проксимального отдела нефрона, что, по-видимому, обусловлено протеинурией (см. таблицу), возможно, вследствие повышения проницаемости гломерулярного фильтра и истощения реабсорбционных механизмов. На ультраструктурном уровне на 15-е сутки развития СД в клубочках отмечались деструкция фенестр эндотелия, вакуолизация и очаговое отслоение его от базальной мембраны (БМ), которая местами была утолщена и пропитана электронно-плотным мелкозернистым материалом. Наблюдались сегментарная пролиферация мезангиоцитов и в отдельных петлях капилляров скопления прилежащих к эндотелию тромбоцитов. Через 60 сут в клубочках нарастала деформация капиллярных петель вплоть до полной облитерации (рис. 2), БМ была утолщена и разрыхлена на обширных участках и местами лишена эпителиального покрытия. В просвете капсулы и ме- зангиуме накапливался электронно-плотный материал. Отмечались скопления пристеночно расположенных тромбоцитов (до 10—20 в поле зре-

Рис. 2. Капиллярные петли клубочка крысы с аллоксановым диабетом (60 сут).

1 — БМ; 2 — просвет капилляра; 3 — вакуолизация эндотелия; 4 — подоциты; 5 — ножковые отростки подоцитов. У в. 7000.

Рис. 3. Участок капиллярной петли почки крысы с аллоксановым диабетом (60 сут).

1 — БМ; 2 — эритроцит; 3 — тромбоциты; 4 — дегранулированный тромбоцит. Ув. 12 000.

ния), часть из которых была дегранулирована (рис. 3). Эти изменения клубочков указывают на микрососудистые повреждения, эквивалентные описанным в литературе ранним изменениям клубочков при ДН [1, 9].

Таким образом, нами выявлен комплекс нарушений показателей тромбоцитарно-сосудистого гемостаза у крыс с СД: усиление агрегации и продукции МДА тромбоцитами, указывающее на повышение их реактивности, и прогрессирующее снижение АА аорты. При этом различные функции тромбоцитов изменялись не одновременно: более ранние изменения (на 15-е сутки) отмечались со стороны процессов липопероксидации (увеличение образования МДА) и дезагрегации, тогда как агрегация изменялась лишь на 60-е сутки течения СД. Усиление ПОЛ в тромбоцитах сочетается с общей активизацией свободнорадикального окисления липидов при СД в плазме крови (см. таблицу) и в тканях, что согласуется с данными работ [4, 8]. Причиной усиления ПОЛ, в том числе в тромбоцитах, считают нарушения липидного обмена при дефиците инсулина и недостаток антиоксидантных систем защиты, в частности ос-токоферола [3, 4].

Ослабление АА аорты у крыс с СД, по-видимому, связано со спецификой метаболизма АК в стенке сосуда и обусловлено угнетением активности PgI2-CHHTeTa3w избытком продуктов ПОЛ при СД [13]. В литературе также описан дисбаланс между проагрегантными простаноидами тромбоцитов и антиагрегантными простаноидами сосудистой стенки в сторону превалирования первых у больных ИЗСД и у крыс со стрептозотоци- новым диабетом, осложненным МА [3, 5], что является важным фактором нарушения тромбоцитарно-сосудистого взаимодействия, приводящего к гиперагрегации.

Существенно, что активация тромбоцитов in vivo, о чем свидетельствует повышение содержания МДА в неактивированных тромбоцитах, отмечалась в те же сроки СД (на 15-е сутки), что и признаки МА — протеинурия, утолщение мезангия клубочков (см. таблицу), коррелирующие с уровнем гликемии (г = +0,53; р < 0,05). В дальнейшем усиление внутрисосудистой активации тромбоцитов, на что указывает появление дегра- нулированных клеток в тромбоцитарных агрегатах (см. рис. 3), сочеталось с усилением повреждения эндотелия, утолщением мезангия, накоплением электронно-плотного материала в стенке и просвете сосудов и другими показателями формирующейся МА. Отмеченные нами изменения клубочков почки при аллоксановом диабете согласуются с данными работы [1]. Однако в доступной нам литературе не удалось найти описания участия тромбоцитов в повреждении сосудистой стенки на ранних этапах экспериментального диабета.

Сопоставление свойств тромбоцитов и сосудистой стенки с изменениями в почечных клубочках в ранние сроки развития сосудистых повреждений у крыс с СД позволило продемонстрировать тесную связь между появлением и накоплением пула гиперреактивных тромбоцитов и состоянием стенки сосудов in vivo и in vitro. По-видимому, возникающие при СД нарушения углеводного и жирового обмена и их последствия (полиоловый путь метаболизма глюкозы, неферментное глико- зилированние белков, активизация ПОЛ) затрагивают и тромбоциты, и эндотелий, однако степень изменения каждого из них зависит от местных условий в различных сосудистых бассейнах. Существуют определенные особенности гемодинамики в клубочках при СД. Можно предположить, что внутриклубочковая гипертензия как дополнительный фактор обусловливает реализацию активности подготовленных (гиперреактивных) тромбоцитов — агрегацию и высвобождение проагреган- тов и вазоконстрикторов (серотонин, тромбоксан А2 и др.) и продуктов ПОЛ (МДА), которые, вызывая спазм сосудов и повреждения эндотелия, нарушают микроциркуляцию в клубочках, способствуют микротромбозу и формированию ДН.

Выводы

Выявлен параллелизм между появлением ранних признаков ДН, протеинурией и наличием пула гиперреактивных тромбоцитов, которым принадлежит определенная роль в механизмах повреждения сосудов клубочков на ранних этапах формирования диабетической ангиопатии.