Врожденные аномалии тиреоидного метаболизма могут привести к замедлению роста и умственного развития, поэтому для обнаружения заболевания на начальной стадии и своевременного лечения необходима программа скрининга новорожденного. Около 3—5% случаев врожденного гипотиреоза обусловлены дефектом синтеза или структуры основного белка щитовидной железы тиреоглобулина (ТГ).ТГ — йодсодержащий гликопротеин, в составе которого осуществляется биосинтез тиреоидных гормонов. Нативный ТГ состоит из 2 идентичных 128-субъединиц с мол. массой по 330 кД, кодируемых 33S мРНК. мРНКур — одна из самых больших мРНК, описанных у млекопитающих; ее мол. масса составляет 2,8 • 10б Д. В последние годы ТГ стал объектом молекулярно-биологических исследований: на матрице мРНКТр удалось синтезировать 2-нитевую кДНК полной длины, т. е. получить полный структурный ген ТГ [9].Протяженность гена ТГ более 300 т. п.н. В геноме человека ген ТГ представлен 1 копией. Он содержит не менее 37 экзонов, разделенных интронами. Между 51- и 3 ^областями гена ТГ обнаружены значительные структурные различия: все экзоны, кодирующие З1-область мРНК, примерно одинакового размера (100—200 т. п.н.), в З^об- ласти среди экзонов одинакового размера имеются экзоны размером 1120 и 560 п.н.; в З^области обнаружены интроны размером 64 т. п.н., в то время как размеры интронов 5 ^концевого сегмента не превышают 8 т. п.н. [5].Вследствие большого размера гена ТГ ожидается, что он подвержен значительному числу инактивирующих мутаций. Природа дефектов в гене ТГ при наследственных заболеваниях щитовидной железы человека неизвестна, поэтому молекулярно-генетические исследования этих заболеваний основаны на семейном анализе распределения нормальных полиморфных участков узнавания рестриктаз, т. е. на изучении нормального полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). В последние годы в литературе обсуждаются перспективы изучения ПДРФ для диагностики наследственных заболеваний щитовидной железы [3, 4].Основной целью данной работы были проведение популяционно-генетического анализа ПДРФ, выявляемого в гене ТГ, и отработка системы молекулярно-генетических исследований наследственных заболеваний щитовидной железы, связанных с полинуклеотидными перестройками в структуре ТГ.Tg-gene s'СНТ 16 > Ч Ч Ч Ч 2 2 !Ц- 9.рент 16 ? — ? 2 2в,о 3,2Рис. 1. Организация 5'-конца гена ТГ.Рестриктная карта космидного клона и (рестриктаза EcoRI).Материалы и методыДНК из лейкоцитов человека выделяли методом фенольной экстракции [2]. Рестрикционный анализ проводили с помощью рестриктаз BamHI, Hindi!], EcoRI, EcoRV, MstI, Pvull (НПО "Фермент", Вильнюс). Фрагменты ДНК (1 мкг на пробу) разделяли методом электрофореза в 0,8% агарозном геле по методу Р. Sharp и соавт. [7]. Перенос ДНК из геля на нейлоновые фильтры ’’Biodan'' осуществляли по методу Е. Southern [8]. Введение радиоактивной метки в ДНК проводили методом нуклеотидного замещения радиоактивной метки в ДНК по Р. Riqby и соавт. [6] с помощью ДНК-полимераз E.coli. Гибридизацию проводили с меченными 32Р ДНК вышеуказанных клонов (удельная активность 107—108 cpm/мкг) в течение 18 ч при 65°С в смеси, содержащей 4Х ССР, 4-крат- ный раствор Денхарта, 0,5 мг/мл поли (У), 0,1% SDS, 5% декстрансульфата. После гибридизации фильтры тщательно отмывали и подвергали авторадиографии в течение 5—15 дней при —70’С, используя пленку РМ-1 и усиливающие экраны.Результаты и их обсуждениеГен ТГ человека картирован в длинном плече хромосомы 8 в области полосы q24, что было подтверждено как гибридизацией in siti, так и блот- анализом по Саузерну соматических клеток гибридов человек — грызун [4].Для изучения ПДРФ были использованы зонды, охватывающие З'-конец гена ТГ (рис. 1).В исследованиях заболеваний большое значение имеет определение гетерозиготного носительства, т. е. выявление в популяции индивидуумов, у которых нет данного заболевания, но они гетерозиготны по рецессивной мутации, которая способна выявить эту болезнь.При расщеплении образцов ДНК крови здоровых жителей Ташкента рестриктазами EcoRV и Taql с последующим блот-анализом были обнаружены 2 пары альтернативных вариантов нормального ПДРФ — 13,8 или 8,5 и 5,8 или 5,2 т. п.н. соответственно (рис. 2). Для каждого фермента было тестировано по 40 индивидуумов. В табл. 1 приведены распределения генотипов по рестрикционным полиморфным сайтам EcoRV и Taql в гене ТГ здоровых доноров — жителей Ташкента.Частота встречаемости EcoRV- и Taql-полиморфизма в гене ТГ составила 33 и 21% соответственно (табл. 2).Рис. 2. Авторадиограф образцов ДНК из донорской крови, обработанных рестрик- тазами EcoRV (а) и Taql (о).Рис. 3. Авторадиограф образцов ДНК из крови больных, обработанных рестрикта- зами EcoRV (а) и Taql (б).а: 1 — норма, 2 — отец, 3 — дочь, 4 ~ мать; о: 7 — мать, 2 — норма, 3 — отец, 4 — дочь.Для исследования ПДРФ в гене ТГ при врожденном гипотиреозе были проанализированы образцы ДНК 2 семей (мать, отец, дочь) с клиническим диагнозом врожденного гипотиреоза. Найдены 2 пары альтернативных вариантов ПДРФ, выявляемых при расщеплении ДНК рестрикционными эндонуклеазами (EcoRV-зондом рсНТ 16/ 3,2 и Taql-зондом рсНТ 16/8,0 в зависимости от присутствия или отсутствия полиморфного сайта) — 13,8 или 8,5 и 5,8 или 5,2 т. п.н. (рис. 3).Как известно, наличие у человека той или иной формы ПДРФ — характеристика чисто вероятностная; чем больше вариантов ПДРФ, связанного с данным геном, имеется в данной популяции, тем больше вероятность того, что удастся подобрать нужную рестриктазу. В этом отношении ген фенилаланингидроксилазы оказался весьма удачным. Частота встречаемости ПДРФ в гене фенилаланингидроксилазы составляет более 80%, что обеспечивает возможность диагностики фе-Таблица 1Распределение генотипов в гене ТГ здоровых жителей ТашкентаПДРФ Генотип ПопуляцияEcoRV + + 37+ - 13040Taql + + 32+ - 8040

Примечание. + присутствует сайт рестрикции, — отсутствует сайт рестрикции.нилкетонурии в абсолютном большинстве семей с возможным риском данного заболевания [1]. В случае заболеваний щитовидной железы ПДРФ оказался неожиданно редким, что ограничивает круг семей, в которых возможна диагностика. Так, при средней частоте замен и нуклеотидов в рамках нормального полиморфизма, составляющей примерно 1 замену на 100—200 п.н., в случае гена ТГ из "прозондированных" с помощью большого набора рестриктаз 1164 п.н. полиморфизм наблюдался лишь в 1 случае с очень низкой частотой — около 2% [2].ПДРФ обнаруживается в 51- и З1-областях гена ТГ с разной частотой. Если в З-концевой области выявлен всего лишь 1 редко встречаемый ПДРФ, то в 5^области выявлены 2 высокоповторяемых ПДРФ. Частота встречаемости EcoRV и Taql ПДРФ составила 15 и 20% соответственно. Эти 2 высокочастотных ПДРФ в 51-части гена могут быть использованы для исследования не только врожденных аномалий синтеза ТГ, но и сцепления в области теломеры хромосомы 8q [4].Наши результаты, а также данные об обнаружении 2 высокочастотных ПДРФ в 5^области гена ТГ дают возможность использовать ПДРФ вТаблица 2Частота полиморфных сайтов рестрикции в гене ТГ здоровых жителей ТашкентаПДРФ Показатель ПопуляцияEcoRV р 0,33 ± 0,04Q 0,67N 40Taql Р 0,21 ± 0,06q 0,79N 40

Примечание, р и q — частота положительных и отрицательных сайтов рестрикции соответственно, N — число случаев. качестве маркера для исследования врожденных аномалий синтеза ТГ, а в дальнейшем и для ДНК-диагностики этих заболеваний.Выводы1. Проведен популяционно-генетический анализ ПДРФ, выявлялемого в гене ТГ. При расщеп- * лении образцов крови здоровых жителей Ташкента рестриктазами EcoRV и Taql были обнаружены2 пары альтернативных вариантов нормального ПДРФ — 13,8 или 8,5 и 5,8 или 6,2 т. п.н. соответственно.2. С целью выявления ПДРФ в гене ТГ при врожденном гипотиреозе проанализированы образцы ДНК 2 семей (мать, отец, дочь) с клиническим диагнозом врожденного гипотиреоза и обнаружены те же варианты ПДРФ, что и у здоровых индивидуумов.