В табл. 1 показано, что при разделении белков гипофизарных экстрактов с помощью гель-электрофореза относительная подвижность (Rf) полосы, соответствующей СТГ крыс, не изменяется достоверно с возрастом. Это дало возможность использовать экстракт аденогипофизов взрослых крыс в качестве «носителя» при определении интенсивности секреции 14С-меченного СТГ электрофоретическим методом в группах неонатальных и препубертатных животных.

Для анализа распределения меченых белков при электрофорезе столбик геля разрезали на сегменты толщиной около 5 мм, деполимеризовали Н2О2, и просчитывали затем радиоактивность в толуол-этанольном сцинтилляторе на бета- спектрометре.

Использовали следующие препараты: специфический кальциевый ионофор А23187 («Calbiochem AG», Швейцария); избирательный кальцийхелатирующий агент этиленгликоль-бис (Р-аминоэтиловый эфир) — N,N,N',N'-TeTpaaueTaT натрия (ЭГТА), аналоги циклических нуклеотидов И6,Сг’-дибутирил- аденозин-3',5'-монофосфат (Bt2cAMP) и №О2-дибутирил- гуанозии-3',5'-монофосфат (Bt2cGMP) («Sigma Chemical Со.», США). Статистическая обработка результатов, представленных в виде М + т, проведена с использованием /-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Как показано на рис. 1, в гипофизарной культуре неонатальных крысят СТГ является доминантным, синтезированным de novo белком, который накапливается внутри клеток и освобождается в среду инкубации. Пик на границе между концентрирующим и разделяющим гелем нами не рассматривался, так как соответствовал радиоактивности высокомолекулярных компонентов, не входящих в мелкопористый разделяющий гель.

Известно, что при электрофорезе белков секреторных гранул аденогипофизов взрослых

Таблица 2

Радиоактивность электрофоретически выделенной полосы СТГ в пробах среды 3-часовой инкубации и гомогената гипофизарных клеток крыс разного возраста (п=3 в каждой группе)

Примечание. Для всех показателей возрастные различия недостоверны (р>0,05).

крыс определяемые с помощью биотестов лютеинизирующий и тиреотропный гормоны локализуются в районе между полосой СТГ и границей концентрирующего и разделяющего геля [11]. Однако вследствие малого содержания в гипофизе (а тем более в первичной культуре) эти гормоны не дают ни четких полос при окрашивании электрофореграмм амидо черным 10В, ни пиков на радиоактивных белках [2].

Ранее нами было установлено, что в среде инкубации и гомогенате аденогипофизарных клеток взрослых самок крыс преобладает вновь синтезированный пролактин (R(~0,82—0,84) [2, 3]. Представленные на рис. 1 результаты подтверждают вывод о незрелости лактотропной функции неонатальных гипофизов, сделанный нами в предыдущей работе на основании измерения базальной секреции пролактина гомологичным радиоиммунологическим методом [8].

Сравнительная оценка полосы радиоактивности СТГ, полученной при электрофорезе проб гомогената и среды инкубации гипофизарных клеток крыс, показала лишь незначительное усиление соматотропной функции с возрастом (табл. 2). Доля СТГ, секретируемого в 3 ч инкубации, не различалась существенно между разными возрастными группами (см. табл. 2). Это говорит о том, что механизмы базальной секреции СТГ являются вполне зрелыми уже в клетках неона-

Рис. 2. Действие кальцийрегулирующих агентов на секрецию СТГ в культурах гипофизарных клеток крыс разного возраста: неонатальных (а), препубертатных (б) и взрослых (в).

По вертикали — уровень СТГ в среде (в нг/мл); по горизонтали: 1 — контроль; 2 — А23187 (5 мкМ); 3 — ЭГТА (2 мМ). Длительность инкубации 3 ч, я=5—8 в группе. Одна звездочка — р<0,05, две звездочки — р<0,01 по сравнению с соответствующим контролем.

Таблица 3

Влияние дибутирилпроизводных циклических нуклеотидов и бутирата натрия (по 2,5 мМ) на секцию СТГ в культурах гипофизарных клеток крыс разного возраста (длительность инкубации 3 ч, л=5—9 в группе)

Примечание. Достоверность различий по отношению к контролю в данной группе; одна звездочка — р<0,01, две звездочки — р<0,001.

тальных гипофизов, а имеющиеся небольшие возрастные различия радиоактивности полосы СТГ в гомогенате клеток и среде инкубации обусловлены, видимо, различным содержанием сомато- трофов в ткани гипофизов крыс разного возраста [14].

Исследования, проведенные нами с использованием гомологичного радиоиммунологического анализа, показали достаточно высокую базальную скорость освобождения СТГ у неонатальных крысят, которая в ряде экспериментов была лишь ненамного ниже, чем у препубертатных и взрослых крыс. Кальциевый ионофор А23187 повышал секрецию СТГ, тогда как Са2+ -хелатирующий агент ЭГТА резко снижал освобождение этого гормона, причем не было обнаружено существенных возрастных различий в реактивности соматотрофов к действию кальцийрегулирующих агентов (рис. 2).

Напротив, нами обнаружены отчетливые возрастные особенности влияния аналогов циклических нуклеотидов на секрецию СТГ (табл. 3). Так, Bt2cAMP повышал освобождение СТГ в культуре гипофизарных клеток неонатальных крысят в значительно большей степени, чем в культуре взрослых животных, тогда как Bt2cCMP обладал способностью индуцировать секрецию СТГ лишь в клеточной культуре неонатальных гипофизов. Результаты, полученные нами в отношении эффектов аналога сАМР, согласуются с результатами других авторов [17]. Важно отметить, что бутират натрия не изменял достоверно секреторную активность соматотрофов, а, следовательно, наблюдаемые нами эффекты дибутирилпроизводных циклических нуклеотидов не опосредованы бутиратом, который может освобождаться при гидролизе этих аналогов в процессе инкубации.

Таким образом, нами обнаружены возрастные особенности вклада циклических нуклеотидов в механизмы регуляции освобождения СТГ. Ранее отмечалось, что созревание гормонокомпетент- ности сопровождается изменением степени сопряжения отдельных компонентов мембранного комплекса рецептор — G-белки — аденилатциклаза [6]. Наши результаты и данные других авторов [6, 17] свидетельствуют о наличии иного механизма возрастных различий — на уровне пострецепторных событий, скорее всего сАМР- и cGMP- зависимых протеинкиназ, а возможно, и следующих за ними эффекторных стадий.

В связи с тем что между циклическими нуклеотидами и Са2+ существует множество взаимодействий (обозначаемых обычно как crosstalk [9]), обнаруженное нами отсутствие возрастных различий роли Са24- в регуляции секреции СТГ позволяет сузить возрастные особенности регуляторных механизмов в соматотрофах только до вклада собственно циклических нуклеотидов. Имеются ли возрастные различия роли продуктов фосфоинозитидного обмена и возможных других вторичных мессенджеров в регуляции освобождения СТГ, предстоит установить в дальнейших исследованиях.

Выводы