В клинической химии определение прогестерона (П) используется для выявления возможности самопроизвольных абортов и контроля за лекарственной терапией при лечении бесплодия, а также как показатель овуляции. В ветеринарии определение П широко применяют для контроля овариального цикла и оценки репродуктивного статуса крупного рогатого скота [2, 8].

Несмотря на высокую чувствительность и специфичность радиоиммунологического и иммуно- ферментного анализа (ИФА) П [4, 6, 7, 10, 12, 14], эти методы обладают такими недостатками, как значительное время проведения анализа (2— 3 ч), многостадийность, использование радиоактивных изотопов. Многие методики включают стадию длительной подготовки образцов (экстракция, очистка из образца) и операции разделения свободных и связанных с антителами компонентов.

Быстрым и надежным методом определения П является безразделительный (гомогенный) поляризационный флюороиммуноанализ (ПФИА). Принцип ПФИА, описанный ранее в ряде обзоров [1, 5], основан на конкурентном взаимодействии определяемого антигена и трейсера (антиген, меченный флюоресцентной меткой) с ограниченным числом центров связывания антител. Поляризация флюоресценции меченого антигена в растворе имеет небольшое значение и существенно возрастает при образовании иммунного комплекса: чем выше концентрация определяемого антигена в пробе, тем в большей степени меченый антиген в реакционной смеси будет в свободном состоянии и ниже значение поляризации флюоресценции. Данный метод анализа не требует стадии разделения компонентов иммунной реакции и позволяет определять концентрацию антигена в течение нескольких минут. К преимуществам ПФИА следует также отнести простоту выполнения анализа, отсутствие длительной подготовки проб, стабильность меченых реагентов и антител при длительном хранении, хорошую точность и воспроизводимость результатов.

В настоящей работе предлагается методика безразделительного определения Г методом ПФИА на приборе TDx фирмы «Abbott» (США) с использованием поликлональных антител к конъюгатам 3-карбоксиметилоксима прогестерона (З-CMO-Prog) и 11 «-гемисукцината прогестерона ( 1la-HS-Prog) с белком-носителем.

Материалы и методы

Реактивы: 1 -этил-3- (3-диметиламинопропил) -карбодиимид, этилендиаминфлюоресцеин, N-гидроксисукцинимид, N.N-диме- тилформамид, З-CMO-Prog, бычий у-глобулин, азид натрия, стероидные гормоны: П, 11а-гидроксипрогестерон, кортизол, тестостерон, деоксикортикостерон, кортикостерон («Sigma», 'США).    ■

Буферы, и стандарты. Использовали 0,1 М боратный буфер с 0,1 % азидом натрия и 0,1 % бычьим у-глобулином (буфер TDx, pH 7,4). Стандартные растворы гормонов готовили растворением точных навесок веществ (10 мг) в 10 мл метанола. Из полученных матричных растворов (1 мг/мл) при разбавлении буфером TDx были приготовлены растворы гормонов нужной концентрации. Далее при проведении анализа из этих растворов готовили путем двукратного разведения стандарты с.необходимой концентрацией соответствующих гормонов.

Измерение поляризации флюоресценции проводили с помощью автоматизированного поляризационного флюориметра TDx-анализатора фирмы «Abbott Laboratories» (США) в полуавтоматическом режиме по программе «Photo Check» (возбуждения — 485 нм, ширина волны возбуждения — 8 нм, эмиссии — 525—550 нм, детектор — фотоумножитель, источник света — вольфрам-галогеновая лампа, 50 Вт). Загрузка карусели одного анализа от 1 до 10 образцов. Время полного анализа при полной загрузке карусели 5—7 мин. Объем реакционной смеси в кювете 1 мл.

Поликлональные антитела. Специфичные к П поликлональные антитела получены при иммунизации кроликов. Поликлональные антитела П (1—8) различных циклов иммунизации получены в НПП «Иммунотех» (Москва) к конъюгату З-CMO-Prog с бычьим сывороточным альбумином (BSA), поликлональные антитела Lot 0422-3 и Lot 418 получены конъюгатам З-CMO-Prog и (1 la-HS-Prog) соответственно с гемоцианином моллюска (KLH) и предоставлены фирмой ILS (Англия). Поликлональные антитела Ab-Prog получены к конъюгату l la-HS-Prog с BSA в Институте ветеринарии Брно (Чехо-Словакия).

Синтез трейсера З-CMO-Prog, меченного флюоресцеином (З-CMO-Prog-EDF). Синтез проводили карбодиимидным методом по аналогии со способом, описанным в работе [11] для синтеза 3-карбоксиметилоксима кортизола, меченного флюоресцеином. К раствору 8 мг (20 мкмоль) З-CMO-Prog в 1 мл диметилформамида добавляли 4 мг (40 мкмоль) N-гидроксисукцинимида и 8 мг (40 мкмоль) карбодиимида. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 1 ч и добавляли суспензию 10 мг (20 мкмоль) этилен- диаминфлюоресцеина в 3 мл диметилформамида. Реакционную. смесь перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре и инкубировали 2 дня при 4 °С, затем добавляли метанол и отгоняли в вакууме органический растворитель. Остаток растворяли в 0,5 мл метанола и хроматографировали на силикагельных пластинках для тонкослойной хроматографии ( « S ilu fol », ЧСФР) в системе этилацетат — метанол —

Рис. 1. График титрования поликлональных антисывороток. Антисыворотки: / — Lot 0422-3; 2 —П-8; 3 —Lot 418; 4 — нормальная сыворотка.

По оси ординат (здесь и на рис. 2) — поляризация флюоресценции (в шР); по оси абсцисс — разведение антисыворотки.

Таблица 1

Титры поликлональных антител к П, рассчитанные методом ПФИА с трейсером 3-CMO-Prog-EDF

Антитела

Иммуноген

Титр антител (обратная величина)

Lot 0422-3 (Англия)

П-7 (14.11.91)'

П-7 (18.09.91)

Lot 418 (Англия)

П-8 (14.11.91)

П-1 (14.11.91)

П-7 (20.02.92)

П-5 (14.11.91)

Ab-Prog (Чехословакия)

П-4 (14.11.91)

3-CMO-Prog-KLH 3-CMO-Prog-BSA 3-CMO-Prog-BSA 1 la-HS-Prog-KLH 3-CMO-Prog-BSA 3-CMO-Prog-BSA 3-CMO-Prog-BSA 3-CMO-Prog-BSA 1 la-HS-Prog-BSA 3-CMO-Prog-BSA

1300

800

800

700

600

340

300

300

300

280

уксусная кислота в соотношении 90:10:1 (по объему). Из полученных с пластинок основных желтых полос с различными Rt экстрагировали каждое вещество в 2 мл метанола. Растворы разбавляли буфером TDx до нужной концентрации. Трейсер З-CMO-Prog-EDF имел Rf=0,9.

Определение концентрации раствора трейсера проводили спектрофотометрически (спектрофотометр «Beckman DU-6B», США) при 492 нм (коэффициент экстинкции флюоресцеина 6,78 л/ Мхсм). Для этого в кювете для спектрофотометра 50 мкл одного из полученных растворов разбавляли 2 мл буфера и измеряли оптическую плотность полученного раствора. Раствор трейсера разбавляли до концентрации 15,5 нмоль/л и использовали в анализе, описанном ниже.

Определение титра антисывороток. Титры антисывороток определяли методом поляризации флюоресценции. В 10 кювет стандартной карусели прибора разливали по 0,5 мл буфера. В 1-ю кювету добавляли 0,5 мл антисыворотки в соответствующем начальном разведении, а в следующие вносили по 0,5 мл полученного раствора до 9-й кюветы включительно. Затем во все кюветы добавляли по 0,5 мл раствора трейсера в концентрации 15,5 нмоль/л, после чего измеряли поляризацию флюоресценции по программе «Photo Check».

Анализ П методом ПФИА. В стеклянную кювету к 50 мкл стандарта П добавляли 0,5 мл раствора трейсера в концентрации 15,5 нмоль/л и 0,5 мл антисыворотки в рабочем разведении. Загружали 10 кювет в карусель для выполнения теста «Photo Check» и измеряли поляризацию флюоресценции в полуавтоматическом режиме.

Результаты и их обсуждение

В результате синтеза трейсера и его очистки методом ТСХ с полученной хроматограммы были собраны продукты реакции с Rf 0,15, 0,7, 0,75, 0,9. Изучение связывания этих компонентов со специфическими антителами методом ПФИА показало, что трейсер со значением Д=0,9 обладает более высоким специфическим связыванием, вследствие чего он был выбран для дальнейших исследований.

Изучение связывающей способности поликлональных антисывороток проводили методом ПФИА, сравнивая их титры при 70 % связывания меченого антигена (рис. 1). Результаты,приведенные в табл. 1, свидетельствуют о том, что титр антисывороток (интегральная характеристика, определяемая концентрацией и аффинностью антител) зависит от количества циклов иммунизации, структуры иммуногена и его качества, а также от индивидуальных особенностей иммунной системы животного. Из имеющихся антисывороток в их оптимальном разведении, установленном в результате экспериментов, лучшими были П-7,8 (14.11.91), Lot 0422-3 в разведении 1600 и Lot 418 в разведении 1:320.

Для оптимизации метода ПФИА П варьировали объем образца, концентрацию трейсера и степень разведения антисыворотки. Концентрация меченого антигена была близка к минимально детектируемой на используемом приборе. Концентрация трейсера должна обеспечивать значение интенсивности флюоресценции порядка 2000— 3000 усл. ед. В данном анализе эта концентрация составила 15,5 нмоль/л. Она позволяла получить воспроизводимые калибровочные графики при экономном расходовании реагентов. Калибровочные кривые ПФИА П с использованием различных поликлональных антисывороток представлены на рис. 2. Разработанный метод анализа является гомогенным, равновесие в системе устанавливается практически сразу после смешения реагентов. Диапазон определяемых данным методом концентраций П составил от 1 до 1000 нг/мл.

С целью изучения влияния структуры иммуногена на результаты анализа было исследовано поведение в анализе поликлональных антител, полученных к конъюгатам З-CMO-Prog-KLH (гомологичный анализ) и 1 la-HS-Prog-KLH (гетерологичный анализ). Структуры этих иммуногенов изображены на рис. 3. Как правило, антитела вырабатываются на антигенную детерминанту, фрагмент белка-носителя и на химическую «ножку», соединяющую между собой гаптен и бе-

4 П-мы эндокринологии № 4

Рнс. 2. Калибровочные графики для ПФИА П.

/ — гомологичный анализ (антисыворотка Lot 0422-3, разведение 1:600); 2 гетерологичный анализ (антисыворотка Lot 418, разведение 1:320). По ос абсцисс — концентрация прогестерона (в мкг/мл).

d-GHzcaiH(GH2)zMHCSr-iH

Рис. 3. Структуры иммуногенов (/, //) и трейсера (III), используемых при определении П методом ПФИА.

/ — 3-CMO-Prog-BSA (-KLH)i II — 1la-HS-Prog-BSA (-KLH); /II — 3-СМО- Prog-EDF; F — флюоресцеин.

лок-носитель [3]. В предлагаемой работе исследовались иммуногены, один из которых (3-CMO-Prog- KLH, см. рис. 1, 2) является гомологичным по своей структуре используемому в анализе трейсеру (З-CMO-Prog-EDF, см. 2, III), а другой (l la-HS- Prog-KLH, см. рис. 2, II) — гетерологичным ему как по месту присоединения белка-носителя, так и по структуре химической «ножки». Калибровочные графики для гомологичного (антисыворотка Lot 0422-3, разведение 1:600) и гетерологичного (антисыворотка Lot 418, разведение 1:320) ПФИА П приведены на рис. 2. На данном рисунке видно, что при гетерологичном анализе достигается более высокая чувствительность по сравнению с гомологичным. Это согласуется с данными литературы, полученными для ИФА П [9, 10]. Этот факт можно объяснить следующим образом. Поликлональная антисыворотка, полученная к иммуногену, гетерологичному трейсеру по своей структуре, содержит антитела, обладающие меньшей специфичностью к трейсеру, чем гомологичные ему антитела. Из этого следует, что вытеснение меченого гаптена немеченым происходит лучше в случае применения гетерологичной антисыворотки, что и позволяет определять меньшие количества П. Следует отметить также, что калибровочные кривые, полученные в результате двух данных анализов, различны по своей форме. Зависимость, характеризующая гетерологичный анализ, имеет вид двух пересекающихся прямых с разным углом наклона. Это свидетельствует о наличии в используемой поликлональной антисыворотке нескольких субпопуляций антител, различающихся по своей аффинности. Высокоаффинная субпопуляция обладает большей связывающей способностью по отношению к определяемому веществу, чем низкоаффинная, что определяет вид данной калибровочной зависимости.

Выполнив 10 повторных измерений нулевого стандарта и используя метод расчета D. Rodbarg [13], при 95 % уровне достоверности мы нашли, что минимальная определяемая концентрация П составила 7 нг/мл для анализа с использованием лучшей антисыворотки отечественного производства (П-8, 14.11.91), 1,6 и 0,8 нг/мл при использовании антисывороток английского производства Lot 0422-3 (гомологичный анализ) и Lot 418 (гетерологичный анализ) соответственно. Полученные значения уступают по величине чувствительности аналогичным величинам для гетерогенных методов анализа П, но последние два значения достаточны для определения необходимых минимальных концентраций П, содержащихся в организме.

Для оценки воспроизводимости результатов анализа использовали 3 промежуточных стандарта, содержащих 0,01, 0,08 и 0,625 мкг/мл П. Измеряли поляризацию флюоресценции для каждого из них 5 раз и рассчитывали по калибровочной кривой средние значения определяемых концентраций и их коэффициенты вариации, которые составили 11, 5,4 и 4,3% соответственно. Коэффициенты вариации концентраций тех же стандартов по результатам трех анализов в разные дни равны 12,2, 8,1 и 6,7 % соответственно. Для определения правильности разработанной методики был проведен тест на линейность, который заключался в последовательном разбавлении буфером стандарта с высоким содержанием П (2,5 мкг/мл) в 2, 4 и 8 раз и последующем измерении поляризации флюоресценции в 5 повторах для каждого разбавления. Затем по калибровочной кривой рассчитывали средние значения концентраций П, соответствующие каждому разбавлению, и находили отношение найденной таким образом концентрации к рассчитанной из концентрации исходного стандарта. Полученные результаты выражали в виде среднего процента аналитического открытия, который в данном методе составил 95, 100, 100 % для каждого последовательного двукратного разбавления контрольного образца соответственно. Данные аналитические характеристики были определены для калибровочной зависимости, полученной с использованием антисыворотки Lot 0422-3 (гомологичный анализ).

Определяя специфичность анализа методом поляризации флюоресценции, мы исследовали перекрестные реакции с родственными П веществами, также принадлежащими к классу стероидных гормонов. Расчет производили при 50 % вытеснении меченого антигена. Максимальный процент перекрестного реагирования для родственного П соединения — 11а-гидроксипрогестеро-

Таблица 2

Перекрестные реакции (в %) различных стероидных гормонов при определении П методом ПФИА

на — составляет 15% (табл. 2). Полученные результаты свидетельствуют о достаточно высокой специфичности анализа с использованием данных антител (Lot 0422-3), что позволяет определять П в присутствии других стероидных гормонов.

В заключение следует отметить, что предложенный метод ПФИА прост, быстр и надежен. Он может быть использован для разработки методики ПФИА определения концентрации П в различных биологических объектах.

Выводы

Изучено влияние структуры иммуногена на результаты ПФИА П. Показано, что нижний предел обнаружения П методом ПФИА с применением антител, полученных к иммуногену 1 la-HS- Prog-KLH, ниже (0,8 нг/мл), чем с использованием антител, полученных к иммуногену 3-СМО- Prog-KLH (1,6 нг/мл).