В плазматических мембранах клеток ряда тканей человека и животных обнаружены участки специфического связывания транскортина (корти- коссероодссязывающего глобулина, КСГ) [1, 13, 16]. Получены доказательства присутствия этого гликопротеина в клетках различных тканей человека и животных с помощью иммунохимических [20, 21, 24, 26] и биохимических [4, 8, 10, 12, 18] методов. Показано поглощение КСГ маткой, почками, гипофизом и жировой тканью крыс [1^4], а также маткой хомяка [23]. Проведены эксппеименты, свидетельствующие о накоплении КСГ клетками МСГ-7 (клеточная линия рака молочной железы человека) [19] и ГАО (клеточная линия гепатомы крысы) [16]. Эти данные указывают на существование механизма переноса КСГ крови через плазматические мембраны внутрь клеток ряда тканей.

В этом плане особый интерес представляет недавно обнаруженное явление избирательного взаимодействия комплексов кортизола и вариантов КСГ, содержащихся в крови беременных женщин,— КСГ нормальной крови доноров (нКСГ) и связанной с беременностью разновидности КСГ (рКСГ) — с мембраной синцитиотрофобла- ста человека [6]. Образование комплекса со стероидным гормоном — необходимое условие для сппцифииеекого взаимодействия нКСГ и рКСГ с участками связывания на мембране синцитиот- рофобласта [3]. Трофобласт не только является тканью-мишенью глюкокортикоидов [17], но, как известно, представляет собой важнейшую часть плацентарного барьера, через который осу- щеетвляется избирательный обмен различными вещеетвами (в том числе стероидными гормонами и белками крови) между кровеносными системами матери и плода. Существование в мембране синцитиотрофобласта двух типов участков специфического связывания [6] с различным сродством к нКСГ и рКСГ, циркулирующим в крови женщин во время беременности, свидетельствует о возможности существования разнообразных физиологических механизмов взаимодействия комплексов гормон — гликопротеин с данной тканью.

Удобной моделью для изучения трансмембранного переноса являются мембранные микровезикулы, которые можно легко получить из щеточной каемки трофобласта плаценты человека [25]. В отличие от культур клеток или образцов ткани микровезикулы не содержат внутриклеточных энзимов или связывающих белков, которые могут влиять на результаты целевых экспериментов. Вместе с тем микровезикулы сохраняют все основные свойства мембраны синцитиотрофобласта и, будучи суспендированными в буфере, представляют уникальную систему, состоящую из двух физических объемов, разделенных селективной мембраной.

Целью настоящего исследования было изучение взаимодействия нКСГ и рКСГ с микровези- кулярной фракцией мембраны щеточной каемки синцитиотрофобласта в условиях, допускающих протекание транспортных процессов.

Материалы и методы

КСГ выделяли из сыворотки ретроплацентаоной крови человека, как описано ранее [2]. Радиойодирование КСГ проводили с использованием препарата «Иодоген» («Pierce», США) [11J. Удельная радиоактивность полученных препаратов ’“Г-КСГ составляла 50—70 мкКи/мкг, а их радиохимическая чистота была не ниже 98%. Иммунохимическая чистота, определенная с помощью моноспецифической антисыворотки к КСГ человека, составляла 100%. В экспериментах использовали [1,2,6,7-3Н] кортизол («Amersham», Англия) с удельной активностью 94 Ки/мМ. Для разделения 1251-КСГ и немеченого КСГ на молекулярные варианты использовали аффинную хроматографию на иммобилизованном конканава- лине А [2].

Везикулярную фракцию мембраны щеточной каемки синцитиотрофобласта получали, как описано ранее [25]. Для этого использовали нормальные послеродовые плаценты человека.

При изучении возможности трансмембранного транспорта нКСГ и рКСГ препарат микровезикул суспендировали в изотоническом буфере, содержащем 0,005 М трис-НС1 pH 7,6, 0,15 М NaCl, 0,01 М СаС12, 0,004 М КС1 и 0,001 MgCl2. Суспензию делили на две равные части, одну разводили в 10 раз изотоническим буфером указанного выше состава (1), другую—дистиллированной водой (2). Через 1 ч осуществляли центрифугирование при 20000 g в течение 1 ч. Полученные осадки интактных микровезикул (1) и разорванных в результате осмотического «шока» микровезикул (мембранных фрагментов) (2) ресуспендировали в изотоническом буфере.

По 0,5 мл суспензии микровезикул (250—350 мкг белка по методу Лоури) вносили в аналитические пробирки, содержащие 0,5 мл изотонического буфера с определенным количеством сахарозы в диапазоне концентраций 0,12—1,5 М либо буфер без сахарозы. Параллельная серия проб содержала вместо микровезикул мембранные фрагменты. Микровезикулы и мембранные фрагменты инкубировали с буфером определенной осмолярности в течение 10 мин при 37° С и затем использовали для изучения трансмембранного переноса кортизола и комплексов нКСГ (рКСГ) — кортизол (прогестерон или тестостерон).

В первом случае в аналитические пробы прибавляли 50 мкл 3Н-кортизола до концентрации в пробе 1-10 8 М. Реакцию останавливали центрифугированием при 10000 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляли, осадки суспендировали в 0,3 мл 5% холата Na и экстрагировали стероид бензолом. Измеряли радиоактивность бензольных экстрактов с помощью счетчика «Mark-Ш» («Тгасог Europa», Голландия).

Во втором случае в аналитические пробы, содержащие микровезикулы (мембранные фрагменты) после преинкубации в буфере определенной осмолярности, прибавляли 50 мкл смеси кортизола (прогестерона или тестостерона) и нКСГ (рКСГ) (‘251-глико1гротеин + немеченый гликопротеин). Окончательная концентрация стероидов в пробах составляла 1-10 _7 М, вариантов КСГ-— 1-Н)“8 М или 1-10 _и> М. Пробы инкубировали при 37° С в течение 1 ч. Остановку реакции осуществляли, как указано выше. Надосадочную жидкость удаляли и измеряли радиоактивность осадков с помощью счетчика радиоактивности «ЮА-Сатта» («ГКВ-\Уа11ас», Финляндия).

После проведения анализа связывания осуществляли контроль за степенью нативности 1251-нКСГ (рКСГ) в надосадочной жидкости. Радиохимическая и иммунохимическая чистота гликопротеинов составляла не менее 90%.

Результаты и их обсуждение

Как упоминалось выше, в плазматической мембране синцитиотрофобласта человека нами обнаружены два типа участков специфического связывания КСГ. Одни из них, высокоаффинные, проявляют сродство к нКСГ и рКСГ, характеризующееся значениями Ка, равными соответственно 2,5-10_11 М и 3,3 -10 “12 М. Другие, относительно низкоаффинные, проявляют более высокое сродство к нКСГ (Ка = 1,6- 10'Ю М), чем к рКСГ (Ка = 4,5 -10 _9 М). Высокоаффинные участки связывания характеризуются более низкими значениями максимальной связывающей емкости (В тах = 3 фмоль/мг), чем относительно низкоаффинные (В шах — 150 фмоль/мг) [6].

Выяснение механизмов взаимодействия нКСГ и рКСГ в комплексе с кортизолом с мембраной синцитиотрофобласта предполагает изучение возможности их проникновения во внутренний объем микровезикул. В первую очередь мы сравнили взаимодействие с микровезикулами свободного гормона (на примере кортизола) и гормона, связанного гликопротеином (нКСГ или рКСГ) при 23 и 37° С (рис. 1). Было найдено, что даже в условиях, когда большая доля кортизола (-90%) находилась в связанном с гликопротеином состоянии, зависимость поглощения связанного 3Н-кортизола микровезикулами от времени практически не отличалась от связывания свободного гормона. Таким образом, гликопротеин не ограничивает поступление гормона в синцитио-

Рис. 1. Временная зависимость связывания 3Н-кортизола микровезикулами при различных температурах в отсутствие гликопротеинов (!) и в присутствии нКСГ (2) и рКСГ (3). 'Концентрация стероида 1 - 10'8 М, гликопротеинов 1 - 10'7 м. Данные типичного эксперимента.

По оси ординат—связанный кортизол (в тыс. имп/мин); по оси абсцисс — время (в мин). трофобласт, и имеется принципиальная возможность для трансмембранного переноса комплекса гормон—гликопротеин. Это согласуется с полученными нами ранее данными [15] о совпадении кинетических параметров взаимодействия с микровезикулами свободного 3Н-кортизола и комплексов 3Н-кортизола с нКСГ либо рКСГ.

Известно, что внутривезикулярный объем явля- т ется функцией осмолярности среды. В частности, была показана [9] линейная зависимость между количеством 3Н-а-аминомасляной кислоты либо 3Н-кортикостерона, поступающих во внутренний объем микровезикул мембраны синцитиотрофоб- ласта, и концентрацией сахарозы в инкубационном буфере. Наша задача состояла в установлении зависимости между величиной связывания микровезикулами 1251-нКСГ и 1251-рКСГ в виде комплексов с кортизолом и концентрацией сахарозы в инкубационном буфере. Поскольку изменение осмолярности буфера может оказывать влияние не только на величину внутривезикуляр- ного объема, но также на текучесть липидов, латеральную подвижность мембранных рецепторов и другие параметры мембраны синцитиотрофобласта [7], в параллельной серии экспериментов определяли влияние концентрации сахарозы в инкубационной среде на связывание 1251-нКСГ и 125 1^-рКСГ мембранными фрагментами, полученными с помощью гипоосмотического «шока» микровезикул, т. е. фрагментами, лишенными внутреннего объема. В экспериментах нКСГ и рКСГ использовали в концентрациях 1- 10 — М (рис. 2, а) и 1- Ю-^ М (рис. 2, б), что позволило изучить их взаимодействие с относительно низкоаффинными и высокоаффинными участками связывания соответственно.

Как видно на рис. 2, связывание микровезикулами 1251-нКСГ (в комплексе с кортизолом), подобно связыванию свободного гормона (рис. 3), зависит от внутривезикулярного объема. Это означает, что нКСГ может проникать внутрь микровезикул. Данный вывод подтверждается тем фактом, что количество 1251-нКСГ, связанное мембранными фрагментами, практически не отличается от величины связывания, рассчитанной с помощью экстраполяции кривой 1 к нулевому значению внутривезикулярного объема.

В отличие от нКСГ, связывание рКСГ микро- ’ везикулами не зависит от внутреннего объема последних (см. рис. 2). При всех используемых концентрациях сахарозы как интактные микровезикулы, так и мембранные фрагменты, полученные с помощью гипоосмотического шока микровезикул, связывали одно и то же количество рКСГ. Это означает, что рКСГ взаимодействует только с поверхностью микровезикул и не может проникать через мембрану синцитиотрофобласта.

Так как рКСГ не ограничивает поглощение кортизола микровезикулами (см. рис. 1), мы полагаем, что рКСГ функционирует как транспортный «челнок», снабжающий трофобласт стероидом. Это согласуется с полученными нами ранее данными [5] об отсутствии рКСГ в крови плода и экстрактах плаценты.

В случае нКСГ, по-видимому, происходит совместный трансмембранный перенос гликопротеина и связанного с ним гормона, причем этот процесс не зависит от природы стероида. Так,

Рис. 2. Зависимость     связывания     1251-

нКСГ (1, 2) и 1251-рКСГ (3, 4) в комплексе с кортизолом микровезикулами (сплошная линия) и фрагментами (пунктирная линия) плазматической мембраны синцитиотрофобласта от осмолярности среды при 37° С.                _

Концентрация кортизола 110 7 м, гликопротеинов 1-НЗ-8 М (а) и 110“1ОМ (6).

По оси ординат — связанный гликопротеин (в тыс. имп/ мин); по оси абсцисс—концентрация сахарозы (в М_ ‘).

параллельное изучение взаимодействия о25О- нКСГ в присутствии насыщающих концентраций кортизола, прогестерона и тестостерона с одним и тем же препаратом микровезикул показало (см. таблицу), что величина связывания нКСГ в комплексе с любым гормоном была практически одинаковой и в равной степени зависела от внутреннего объема микровезикул. Это согласуется с полученными нами ранее данными [3] о соопадении величины мембранного связывания комплексов нКСГ с указанными стероидами при 4° С.

Последствия взаимодействия нКСГ и рКСГ в комплексе со стероидами с каждым из двух известных типов участков связывания, локализованных в плазматической мембране синцитиотрофобласта, не зависят от типа последних (высокоаффинные или относительно низкоаффинные) и определяются исключительно природой гликопротеина (нКСГ или рКСГ). Поскольку эти гликопротеины отличаются только строением углеводных компонентов [5], полученные данные свиддтсетьствуют о том, что олигосахаридные цепи вовлечены не только в первичный акт узнавания данных гликопротеинов связывающими участками, но и в последующие биохимические процессы.

Биологический смысл поступления нКСГ из крови в клетки остается неясным. В работе

6

1

ol-------- 1------- 1_____ j______ |______ I I I

0       7       2      3       4       5       6       7

Рис. 3. Зависимость связывания 3Н-кортизола микровезикулами (1) и фрагментами (2) плазматической мембраны син- цитиотрофобласта от осмолярности среды при 37° С.

Средние значения по результатам трех независимых определений. Концентрация стероида 1 • 10~8 М.

По оси ординат—связанный кортизол (в тыс. имп/мин); по оси абсцисс — концентрация сахарозы (в М’О. [22] высказываются следующие предположения: КСГ доставляет стероиды к внутриклеточным рецепторам стероидных гормонов в защищенной от внутриклеточных ферментов форме; КСГ выполняет самостоятельную биологическую функцию, о чем свидетельствуют активация аде- нилатциклазы и накопление внутриклеточного цАМФ в клетках рака молочной железы человека МСГ-7 после взаимодействия с ними гликопротеина.

Таким образом, можно предположить существование по крайней мере двух различных механизмов проникновения стероидных гормонов в клетки-мишени с участием специфических сте- роидсеязывающчх гликопротеинов: трансмембранный перенос гормон-гликопротеинового комплекса как единого целого; специфическое взаимодействие гормон-гликопротеинового комплекса с мембраной _с последующей диссоциацией комплекса на мембране и переносом гормона внутрь клетки-мишени.

Выводы

Взаимодействие 1251-нКСГ в комплексе с кортизолом (А), прогестероном (Б) и тестостероном (В) с микровезикулами синцити- отрофобласта при различных значениях осмолярности инкубационной среды при 37° С

Примечание. Приведены результаты типичного эксперимента. Концентрация гликопротеина — 1-10 “8 М, стероидов— 1 •10 _1 М.