Врожденный гипогонадотропный гипогонадизм (ВГГ) — снижение функции половых желез, в основе которого лежит нарушение синтеза, секреции или действия гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) — ключевого нейрорегулятора репродуктивной системы млекопитающих. ВГГ может проявляться изолированным нарушением функции ГнРГ, сочетаться с недостаточностью других гормонов аденогипофиза (врожденный гипопитуитаризм) или быть частью синдромов. Клинически принято также выделять вариант ВГГ с гипо-/аносмией (синдром Кальмана), патогенез которого связывают с нарушением миграции ГнРГ-нейронов из обонятельной плакоды в передний мозг в процессе эмбрионального развития [1].

В последние годы благодаря развитию молекулярной биологии и внедрению технологий секвенирования следующего поколения (NGS) достигнут значительный прогресс в изучении ВГГ, и к настоящему моменту известно более 40 генов, ассоциированных с данными состояниями [2]. Наряду с X-сцепленным рецессивным и аутосомно-доминантным вариантами наследования в структуре ВГГ выделяют также аутосомно-рецессивные формы, распространенность которых нередко зависит от «эффекта основателя» и может значительно варьировать в различных этнических группах. В этой связи заслуживает особого внимания рецессивная форма ВГГ, обусловленная дефектами гена GNRHR, кодирующего рецептор ГнРГ. По данным литературы, доля данной формы ВГГ варьирует в широких пределах, колеблясь от 2% [3] до 32% [4].

В настоящем исследовании нами представлено описание 16 пациентов с доказанными дефектами рецептора ГнРГ и оценена частота патогенных вариантов в гене GNRHR в российской популяции.

В группу пациентов с гипогонадотропным гипогонадизмом включены 175 пациентов (мальчики (n=139), девочки (n=36)). Этническая принадлежность обследуемых — русские.

Молекулярно-генетический анализ проводился в лаборатории отделения наследственных эндокринопатий ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России. Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферический крови наборами PureLink® Genomic DNA Mini Kit (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Применялся метод таргетного секвенирования следующего поколения (NGS). Использовалась авторская панель «Гипогонадотропный гипогонадизм» (технология Ion Ampliseq™ Custom DNA Panel, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), содержащая праймеры для мультиплексной ПЦР и секвенирования кодирующих последовательностей следующих 30 генов: CHD7, DNMT3L, DUSP6, FGF17, FGF8, FGFR1, FLRT3, GNRH1, GNRHR, HS6ST1, IL17RD, INSL3, ANOS1, KISS1, KISS1R, LHB, NSMF, POLR3B, PROKR2, RBM28, SEMA3A, SPRY4, TACR3, WDR11, GREAT, TAC3, PROK2, NR0B1, POLR3A, MKRN3. Подготовка библиотек проводилась в соответствии с рекомендациями производителей. Секвенирование осуществлялось на полупроводниковом секвенаторе PGM (Ion Torrent, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Биоинформатическая обработка результатов секвенирования проводилась с помощью программных модулей Torrent Suite 4.2.1 (Ion Torrent, Waltham, MA, USA). Для аннотирования вариантов нуклеотидной последовательности использовался пакет программ ANNOVAR ver. 2018Apr16 [5]. После анализа полученных данных проводилось подтверждение полученных мутаций методом Сэнгера на секвенаторе Genetic Analyzer Model 3130 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Для определения цис- или транс-положения пар гетерозиготных мутаций использовались данные обследования родителей, графический анализ прочтений BAM-файлов, а также TA-клонирование продуктов ПЦР с последующим секвенированием клонов методом Сэнгера. Оценка патогенности вариантов нуклеотидной последовательности проводилась согласно международным и российским рекомендациям [6][7]. Нумерации кодирующей последовательности генов GNRHR, ANOS1 даны по референсам NM_000406 и NM_000216 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) соответственно. Для сравнения частот нуклеотидных вариантов использованы данные gnomAD (https://gnomad.broadinstitute.org/) [8] и базы данных RUEXAC лаборатории ДНК-диагностики ФГБНУ «МГНЦ им. академика Н.П. Бочкова».

По результатам молекулярно-генетического исследования у 16 пробандов (мальчики (n=11); девочки (n=5)) выявлены изменения в гене GNRHR (табл. 1). У 15 пациентов клиническая картина соответствовала нормосмическому гипогонадотропному гипогонадизму, у 1 (пациент №4) — синдрому Кальмана (аносмия установлена клинически на основании жалоб).

15 из 16 пациентов обратились с жалобами на выраженную задержку полового развития в подростковом возрасте (Ме 16,25 года); у одного пациента (№4) диагноз заподозрен в 9,5 года на основании сочетания аносмии с микропенисом и левосторонним крипторхизмом. Физическое развитие всех пациентов соответствовало норме. По данным рентгенографии костей кисти медиана костного возраста соответствовала 14 годам. Нарушение обоняния отмечалось с раннего возраста у пациента 4. Других фенотипических черт, характерных для синдрома Кальмана (дефекты средней линии, тугоухость, бимануальные синкинезы), ни у кого из обследованных выявлено не было.

По результатам гормонального исследования базальные уровни гонадотропинов соответствовали допубертатным значениям: Ме лютеинизирующего гормона (ЛГ) 0,15 Ед/л [ 0,1; 0,34 ]; Ме фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) 0,445 Ед/л [ 0,2; 0,74 ]; Ме тестостерона (для мальчиков) 0,585 нмоль/л [ 0,32; 0,79 ], Ме эстрадиола (для девочек) 39 пг/мл [ 9; 48,8 ]. Всем пациентам старше 14 лет проведена проба с аналогом Гн-РГ, максимальный выброс ЛГ варьировал от 0,1 до 10,3 Ед/л (Ме 0,58 Ед/л [ 0,2; 4,68 ]).

В нашей когорте выявлено 4 варианта изменений нуклеотидной последовательности (табл. 1). Наиболее часто (n=15) идентифицирована мутация p.R139H. Сочетание данного варианта с p.M1T выявлено у 8 пациентов (во всех случаях оба варианта в цис-положении), с p.R262Q — у 4, с p.Q106R — у 2. У всех 16 пациентов определялись биаллельные изменения в гене GNRHR. Все нуклеотидные замены в гене GNRHR описаны ранее при изолированном гипогонадотропном гипогонадизме [9].

У 1 пациента (№4) биаллельная мутация в гене GNRHR сочеталась с ранее не описанной патогенной гемизиготной мутацией в гене ANOS1 (табл. 1).

ГнРГ — гипоталамический декапептид, синтезируемый в нейронах медиобазальной и преоптической областей гипоталамуса и аркуатного ядра, имеет пульсаторный характер секреции и через гипоталамо-гипофизарную портальную систему попадает в переднюю долю гипофиза. ГнРГ осуществляет свое периферическое действие, связываясь со специфическим рецептором (GNRHR) в передней доле гипофиза [10].

Ген GNRHR (OMIM #138850) картирован на длинном плече хромосомы 4 (4q13.2) в 1994 г. (Kaiser и соавт.) [11], состоит из трех экзонов и двух интронов и кодирует рецептор ГнРГ 1 типа (рГнРГ), состоящий из 328 аминокислот и имеющий молекулярную массу 37 731 Да. рГнРГ относится к семейству G-белок-ассоциированных рецепторов, содержит семь трансмембранных доменов и внеклеточный 35-аминокислотный N-концевой домен с двумя предполагаемыми сайтами гликозилирования. Интересно, что этот белок не имеет С-концевого цитоплазматического хвоста, что делает процесс его интернализации относительно медленным [12].

Экспрессия рецептора определяется преимущественно в гонадотрофах передней доли гипофиза, а также в лимфоцитах, клетках молочных желез, яичников и предстательной железы. После связывания со специфическим лигандом рецептор взаимодействует с G-белком, в результате чего происходят активация фосфолипазы С и мобилизация внутриклеточного кальция [13]. Активация рецептора приводит к выбросу гонадотропинов — ЛГ и ФСГ, которые оказывают дальнейшее периферическое действие.

Фенотип нокаутных по Gnrhr мышей имеет сходства с ВГГ у человека и проявляется половым инфантилизмом, низким уровнем половых стероидов и гонадотропинов; помимо этого, отмечаются нарушения минерализации костной ткани и закладки зубов [13].

С момента первого описания мутации с полной потерей функции гена GNRHR в 1997 г. [14] на настоящий момент выявлено более 50 мутаций [http://evs.gs.washington.edu, 15], приводящих в основном к аминокислотным заменам, более редко — к образованию стоп-кодона либо делециям или инсерциям со сдвигом рамки считывания. Выявленные дефекты затрагивают как внеклеточный, так и трансмембранный и внутриклеточный домены рецептора [16–18].

В зависимости от степени нарушения функции рецептора пациенты имеют широкий спектр фенотипических проявлений — от синдрома фертильных евнухов и парциального гипогонадотропного гипогонадизма до более выраженных форм резистентности к ГнРГ, характеризующихся наличием крипторхизма, микропениса, неопределяемым уровнем гонадотропинов и отсутствием пубертата [13][17]. В нашей когорте у всех пациентов клинически определялись выраженные проявления резистентности к ГнРГ, и лишь в одном случае отмечался низконормальный выброс ЛГ на стимуляцию аналогом ГнРГ (пациент № 13). У данного пациента была выявлена компаунд-гетерозиготность по 2 мутациям (p.Q106R/p.R139H), первая из которых характеризуется частично сохраненной функцией рецептора по данным функционального анализа in vitro [14].

рГнРГ не связан с процессом миграции ГнРГ-нейронов из обонятельной плакоды, поэтому при мутациях в гене GNRHR не ожидается нарушение обоняния. Между тем поводом для первоначального обследования одного из наших пациентов (№ 4) была именно аносмия, и последующее молекулярно-генетическое обследование, помимо биаллельного дефекта в гене GNRHR, выявило также патогенный гемизиготный вариант в гене ANOS1, мутации в котором являются наиболее частой причиной синдрома Кальмана. Это наблюдение подчеркивает важность использования мультигенных панелей для выяснения этиологии ВГГ.

Несмотря на то что в данный момент известно много других генов, ассоциированных с развитием ВГГ, мутации GNRHR остаются самой частой причиной развития этого состояния [19]. Однако данные по частоте встречаемости дефектов в гене GNRHR у пациентов с ВГГ значительно варьируют, что определяется критериями включения пациентов в исследование, методом молекулярно-генетического анализа и, не в последнюю очередь, популяционными особенностями. Так, Quaynor и соавт. [3] в рамках многоцентрового исследования в США провели таргетное высокопроизводительное секвенирование с анализом 261 гена-кандидата у 48 пациентов с ВГГ (у 22 — СК) и выявили мутацию GNRHR (p.R35C) у 1 пациента (2,1%). В работе Beranova и соавт. [20], которые прицельно анализировали ген GNRHR у 108 пациентов из США с различными формами ВГГ, мутации были найдены в 5 случаях, что для всей когорты соответствовало доле 4,6%, а в подгруппе 48 пациентов с ВГГ и нормосмией — 10,4%. Как и ожидается для аутосомно-рецессивного типа наследования, наиболее часто изменения в гене GNRHR выявляются при семейных формах ВГГ. В пользу этого свидетельствует, например, публикация Gurbuz F. и соавт. [4], в которой в турецкой популяции было проанализировано 22 семейных случая ВГГ без аносмии, и при анализе ассоциированных с рецессивными формами ВГГ генов (GNRHR, GNRH1, TACR3, TAC3, KISS1R и KISS1) мутации в гене GNRHR выявлены в 7 семьях (31,8%). Интересно, что среди этих 7 семей только в 2 определялись варианты (p.R139H и p.R262Q соответственно), которые встречались в изученной нами когорте больных. Показательно, что, по данным gnomAD [8], общая частота для варианта p.Q106R является самой высокой (табл. 1), что также согласуется с результатами анализа гена GNRHR при ВГГ среди европейцев [9][18][20]. Между тем в нашем исследовании p.Q106R был найден только у 2 пациентов (оба случая — в составе компаунд-гетерозиготной мутации), а чаще выявлялась мутация p.R139H (у 15 пациентов). При оценке популяционной частоты варианта p.R139H по данным RUEXAC она оказалась приблизительно в 9 раз выше, чем частота данного варианта в gnomAD (табл. 1). Следует также отметить, что в 8 из 15 случаев вариант p.R139H был сцеплен (находился на одном аллеле) с заменой р.М1T, что также, по-видимому, является особенностью российской популяции.

Таким образом, нами представлен опыт применения высокопроизводительного параллельного секвенирования для молекулярно-генетической диагностики ВГГ. В обследованной нами когорте мутации в гене GNRHR были наиболее частой причиной данного заболевания, составив 9,1%. Обращает на себя внимание преобладание патогенного варианта p.R139H и его частое сочетание в цис-положении с вариантом р.М1T, что отличает полученные нами данные для российских больных от частот вариантов в гене GNRHR при ВГГ, описанных в других популяциях.