Пролактолиберин (Прл-РГ) — гипоталамический нейрогормон, выделенный из экстракта гипоталамуса крупного рогатого скота [1][2], увеличивал синтез пролактина в клеточной линии, полученной от аденомы гипофиза крыс, и в клетках гипофиза лактирующих крыс [3]. Кроме того, инъекция Прл-РГ стимулировала уровень пролактина в плазме крови у самок крыс в проэструсе, эструсе и метаэструсе и дозозависимым образом повышала уровень пролактина в плазме крови у самцов крыс [4].

Ранее исследований связи Прл-РГ и тревожности не проводилось. Для большинства изученных нейропептидов в настоящее время показано наличие не только физиологических, но и психотропных эффектов. Но если психотропные эффекты кортиколиберина, гонадолиберина, окситоцина, вазопрессина и т.д. активно исследуются, то влияние пролактолиберина на поведение и психику в настоящее время изучено слабо — Прл-РГ считается анорексигенным (снижающим потребление пищи) нейропептидом, который в основном играет роль в регуляции потребления пищи и расхода энергии [5]. Производные Прл-РГ обладают широким терапевтическим потенциалом [6], поскольку Прл-РГ проявляет не только анорексигенные, но и нейропротекторные свойства [7] и участвует в стрессорной реакции [8].

Для врачей эти данные могут представлять интерес, поскольку медицинские препараты, как правило, имеют побочные эффекты. Часто эти эффекты связаны с изменением эмоционального фона. Именно потому, что Прл-РГ и его синтетические аналоги обладают терапевтическим потенциалом, важно учитывать возможное влияние Прл-РГ на эмоциональную сферу, изучению чего и посвящена данная работа.

В данной работе мы исследовали влияние интраназального введения крысам Прл-РГ на тревожность — обязательный компонент стрессорной реакции организма и на реакцию социального предпочтения.

Опыты проводили на 116 самцах крыс Вистар со средней массой 160 г в возрасте 2 мес на момент начала эксперимента в трех независимых сериях. Животных содержали в стандартных условиях при свободном доступе к пище (сухой комбикорм для грызунов) и воде, по 5 особей в клетке. Перед началом эксперимента животных в течение 14 дней ежедневно по 5 мин подвергали процедуре хэндлинга для предотвращения стрессорной реакции на взятие в руки в период проведения экспериментов [9].

Для оценки тревожности животных тестировали во всех сериях экспериментов в приподнятом крестообразном лабиринте (ПКЛ). Тревожность, определяемая по данной методике, отражает естественный страх высоты и открытых пространств у грызунов. Уровень тревожности определяется обратно пропорционально времени, проводимому в открытых рукавах.

Время тестирования составляло 5 мин. После тестирования каждой крысы лабиринт протирали раствором перекиси водорода для уничтожения запаха предыдущего животного. Тестирование проводили с 13 до 17 ч.

На первом этапе эксперимента в трех сериях изучали влияние Прл-РГ на уровень тревожности белых крыс в тесте ПКЛ с использованием различных концентраций.

Животным группы контроля (n=42) за 15 мин до теста ПКЛ вводили физиологический раствор (0,9% NaCl) по 10 мкл в каждую ноздрю. Животным из опытной группы интраназально вводили Прл-РГ (Prolactin-releasing Peptide, Hybio Pharmaceuticals) объемом по 10 мкл в каждую ноздрю (20 мкл на крысу) в дозе 10–10 моль/л (n=29) и в дозе 10–11 моль/л (n=14) за 15 мин до теста.

Во второй серии экспериментов (n=31), через неделю после тестирования в ПКЛ, поведение животных исследовали в тесте «социальное предпочтение».

На ограниченном стенками (высота 35 см) квадратном поле (90×90×70 см) в противоположных углах размещали маленькие клетки, в которых помещали крыс. Клетки были изготовлены из пластмассовых решеток (18×18×18 см), что обеспечивало в ходе эксперимента визуальный, обонятельный и тактильный контакты между животными, но предотвращало агонистические взаимодействия. Подробнее методика описана ранее (Виноградова и др., 2009) [9].

Исследуемых животных делили на две группы. Первой группе (опыт) вводили Прл-РГ по 10 мкл в концентрации 10-10М в каждую ноздрю (20 мкл на крысу) за 15 мин до теста. Второй группе, контрольным животным, вводили 0,9% NaCl (20 мкл на крысу). В одну клетку помещали крысу-чужака — животное, которое ранее ни разу не имело никаких социальных контактов с исследуемым животным, в другую — крысу из той же жилой клетки, что и тестируемое животное. Исследование проводили в светлое время суток с 13 до 16 ч, длительность теста — 5 мин. Тестируемое животное помещали в центр поля. Учитывалось время нахождения крысы на площади рядом с каждой из клеток (10% от общей свободной площади) и на нейтральном пространстве (80%). Все эксперименты снимались на видеокамеру.

Видеозапись поведения животных проводили на вебкамеру Logitech Webcam (Switzerland).

Статистическая обработка проводилась с использованием непараметрических методов статистики: критерия U Манна–Уитни в программе SPSS-17. За уровень статистической значимости принято значение p<0,05.

Исследование было проведено в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986) [10]; Приказом МЗ РФ №119 Н от 1 апреля 2016 г. «Об утверждении Правил лабораторной практики», Principles of Good Laboratory Practice (OECD, ENV/MC/CUEM (98) 17, 1997); ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики» (идентичен GLP OECD); со статьей 11 Федерального закона от 12 апреля 2010 г. №61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств» (ред. от 22.10.14). Были предприняты надлежащие меры по соблюдению биоэтических норм сокращения количества исследуемых животных. На проведение экспериментов было получено разрешение этического комитета в области исследований на животных Санкт-Петербургского государственного университета.

Введение Прл-РГ в концентрации 10-10 ммоль приводило к тому, что крысы проводили меньше времени в открытых рукавах лабиринта, демонстрировали меньшее количество свешиваний и заходов в открытые рукава, чем животные контрольной группы, что свидетельствует о более высоком уровне тревожности у них (табл. 1). Достоверных различий по двигательной активности, количеству стоек, частоте и длительности груминга между отдельными группами не выявлено. Введение Прл-РГ в концентрации 10-11 ммоль не оказывало влияния ни на один из оцениваемых параметров поведения в ПКЛ.

В тесте социального предпочтения средние значения времени, проведенного со «своим» или «чужим» у животных, которым вводили Прл-РГ, достоверно не отличались от данных, полученных в группе контроля (табл. 2). Однако оказалось, что эффект Прл-РГ зависит от исходного уровня тревожности, который был определен в первой серии экспериментов (см. табл. 1). Если выделить две группы животных — низко- и высокотревожных, их реакция на Прл-РГ различна.

После введения Прл-РГ в концентрации 10-10 ммоль крысы с исходно высоким уровнем тревожности (среднее время пребывания в открытых рукавах ПКЛ 25±8 с) не демонстрировали достоверно значимого предпочтения к знакомому или незнакомому животному, т.е. у высокотревожных особей введение Прл-РГ не влияло на предпочтение «знакомца» или «незнакомца» (табл. 3).

Низкотревожные крысы (среднее время пребывания в открытых рукавах ПКЛ 146±21 с) проводили больше времени рядом с незнакомой особью, чем со знакомой. Эти данные совпадают с ранее полученными результатами (Виноградова, Лукина, Жуков, 2009) [9].

После введения Прл-РГ низкотревожные животные меньше времени проводили с чужаком, чем животные из контрольной группы (см. табл. 3), т.е. они демонстрировали предпочтение поведения, сходного с поведением высокотревожных животных группы «контроль».

Наиболее важным результатом данного исследования является то, что интраназальное введение Прл-РГ в наномолярной концентрации приводит к увеличению уровня тревожности, но не оказывает влияния на двигательную активность у крыс. Это указывает на анксиогенный, а не седативный эффект Прл-РГ.

Вероятно, влияние введения Прл-РГ на социальное предпочтение связано именно с изменением уровня тревоги.

В контроле животные с врожденной низкой тревожностью предпочитали общество незнакомца, а животные с врожденной высокой тревожностью, наоборот, — знакомой особи [9]. Это различие связано, вероятно, с балансом мотиваций. В новой обстановке у крысы происходит столкновение двух мотиваций: самосохранения и исследовательской. Можно предположить, что у крыс с высокой базальной тревожностью мотивация самосохранения сильнее исследовательской мотивации, поэтому они предпочитают находиться рядом с животным из своей клетки. У крыс с низким уровнем тревожности менее выражена неофобия, и они на этом фоне могут позволить себе проявить интерес к незнакомому животному, т. е. исследовательскую активность.

Центральные механизмы психотропных эффектов Прл-РГ изучены слабо, но показана возможность взаимодействия Прл-РГ со структурами ЦНС, регулирующими эмоции и стрессорный ответ [6][11]. Клеточные тела, окруженные иммунореактивной меткой, обнаружены, помимо гипоталамуса, в ядре одиночного тракта и вентромедиальном продолговатом мозге [12]. Метка в нервных проекциях присутствует в гипоталамусе, а также и в таламических ядрах, в миндалине и в конечной пластинке продолговатого мозга [12]. мРНК Прл-РГ экспрессируется в ядре одиночного тракта ствола мозга в несколько меньшей степени — в дорзомедиальном ядре гипоталамуса и в вентролатеральном ретикулярном ядре таламуса [12][13].

Рецептор, обладающий высоким сродством к Прл-РГ, назван GPR10 (связанный с G-белком 10) [2]. мРНК GPR10 экспрессируется в нескольких отделах мозга крысы, в первую очередь в таламусе, гипоталамусе и в area postrema [12][14]. Рецептор GPR10 найден и в парабрахиальном ядре, и в прилежащем ядре [1], структурах ноцицептивной системы, а также в гиппокампе [15], участвующем в реализации многочисленных функций, в том числе и стрессорного ответа организма.

Несомненно участие Прл-РГ в стрессорной реакции [8][16]. Нейроны срединного возвышения, продуцирующие Прл-РГ, активируются при электро-болевом раздражении [17]. Мыши с нокаутным геном Прл-РГ реагируют на иммобилизационный стресс иначе, чем контрольные животные: у нокаутов повышено содержание глюкозы и кортикостерона в крови [18]. Прл-РГ-ергические нейроны ядра одиночного тракта активируются стрессорными стимулами [19]. Внутрижелудочковое введение Прл-РГ увеличивает концентрацию кортикостерона и окситоцина в крови, а введение антисыворотки Прл-РГ препятствует стрессорной активации паравентрикулярного ядра гипоталамуса и уменьшает выделение окситоцина в кровь [20].

Подводя итог, наше исследование впервые показало, что Прл-РГ участвует и в эмоциональном компоненте стрессорной реакции: интраназальное введение Прл-РГ увеличивает тревожность крыс, что проявляется в избегании открытых рукавов ПКЛ и в снижении интереса к незнакомым особям в тесте социального предпочтения. Механизмы этих эффектов, а также возможная роль Прл-РГ в формировании тревожных и депрессивных расстройств требуют дальнейшего изучения, но уже сейчас очевидны возможности создания новых противотревожных препаратов на основе производных Прл-РГ.

Источники финансирования. Плановая НИР Института физиологии им. И.П. Павлова РАН по теме 63.1.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Участие авторов. Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.

Благодарности. Мы благодарим П.В. Волчека за техническую помощь.