Оценить особенности стероидогенеза у мужчин с гипогонадизмом при СД2 с помощью тандемной масс-спектрометрии.

Дизайн исследования

Сплошное одномоментное скрининговое одноцентровое неинтервенционное исследование.

Критерии соответствия

Критерии включения: мужской пол, возраст 40–65 лет, установленный диагноз СД2 в соответствии с действующими на момент проведения исследования алгоритмами [16].

Критерии невключения: нарушения пола и развития; патология надпочечников (включая анамнез по наличию заболеваний надпочечников), отсутствие хотя бы одного из яичек, крипторхизм, травмы и/или хирургические вмешательства на половых органах; прием препаратов андрогенов, анаболических стероидов, гонадотропинов, антиэстрогенов или антиандрогенов в момент исследования или в анамнезе; алкоголизм или наркомания.

Критерии исключения: отказ от участия в исследовании, частичное выполнение программы исследования.

Условия проведения

В исследование были включены мужчины с СД2, обратившиеся за медицинской помощью в ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» МЗ РФ.

Продолжительность исследования

Период сбора материала с октября 2021 г. по январь 2022 г.

Описание медицинского вмешательства

Проводился забор крови для исследования в утреннее время натощак (с 7 до 11 ч) из локтевой вены.

Основной исход исследования

Определение особенностей показателей стероидного профиля у мужчин с СД2 в зависимости от наличия гипогонадизма.

Дополнительные исходы исследования

Оценка ассоциации между снижением уровня тестостерона и выработкой других стероидных гормонов у мужчин с СД2.

Анализ в подгруппах

Проводилось сравнение групп пациентов с гипогонадизмом и без такового.

Методы регистрации исходов

Анамнестические данные были получены путем опроса, а также анализа электронной карты МИС qMS (медицинская информационная система ФГБУ «НМИЦ эндокринологии») включенных больных СД. При физикальном обследовании оценивалось состояние полового оволосения, грудных желез и наружных половых органов. Определение общего тестостерона, кортизола, кортизона, 21-деоксикортизола, 11-деоксикортизола, альдостерона, кортикостерона, 11-деоксикортикостерона, прегненолона, прогестерона, 17-гидроксипрегненолона, 17-гидроксипрогестерона, дегидроэпиандростерона, андростендиона выполнялось с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС) на хроматографе Agilent 1290 Infinity II, масс-спектрометре AB Sciex TripleQuad 5500; уровня гликированного гемоглобина — методом ионобменной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с помощью автоматического анализатора BIO-RAD D10. Гипогонадизм диагностировался при уровне общего тестостерона сыворотки крови менее 12,1 нмоль/л.

Осложнения СД диагностировались в соответствии с действующими на момент проведения исследования алгоритмами [16].

Этическая экспертиза

Исследование было одобрено на заседании локального этического комитета ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России «Масс-спектрометрическая диагностика и персонализация лечения синдрома гипогонадизма у мужчин с сахарным диабетом 2 типа» (протокол №21 от 13.10.2021) и в соответствии с приказом №311 об утверждении регламента прав доступа и работы с интеллектуальной собственностью — Базами данных эндокринопатий и/или со сведениями, выгружаемыми из баз данных эндокринопатий, принадлежащих ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» МЗ РФ от 12 августа 2021 г. Представляемая работа является фрагментом неинтервенционной части исследования.

Статистический анализ

Принципы расчета размера выборки: объем выборки рассчитывался исходя из ожидаемой распространенности в 25%, неявки 20% и ширины 95% доверительного интервала 10%.

Методы статистического анализа данных: статистическая обработка полученных данных была проведена с использованием пакета прикладных программ STATISTICA (StatSoft Inc. США, версия 8.0); количественные данные представлены в виде медиан и границ интерквартильного отрезка, качественные — в виде процентов; сравнение групп осуществлялось непараметрическим методом χ2 с поправкой Йейтса для качественных признаков и U-критерия Манна–Уитни для количественных. Корреляционный анализ выполнен методом Спирмена. Поскольку при межгрупповом и корреляционном анализе стероидного профиля проводились множественные сравнения и проверялось 13 гипотез, была использована поправка Бонферрони с перерасчетом уровня значимости p. Статистически значимыми считали различия при p <0,0042.

Объекты (участники) исследования

В исследование были включены 347 мужчин с СД2. Характеристики выборки представлены в таблице 1.

Основные результаты исследования

При сравнительном анализе пациентов в зависимости от наличия гипогонадизма отмечались статистически значимо более низкие показатели предшественников андрогенов 17-гидроксипрегненолона и 17-гидроксипрогестерона у мужчин в группе гипогонадизма (табл. 2).

Кроме того, пациенты с гипогонадизмом имели статистически значимо более выраженное ожирение по сравнению с мужчинами без гипогонадизма.

Дополнительные результаты исследования

С целью оценки ассоциации между снижением уровня тестостерона и выработкой других стероидов у мужчин с СД2 выполнен корреляционный анализ (табл. 3).

Была выявлена положительная статистически значимая корреляция между общим тестостероном и 17-гидроксипрогестероном. Кроме того, 17-гидроксипрогестерон хоть и в меньшей силе, но положительно коррелировал с другими андрогенами — андростендионом (r=0,328; p<0,001) и дегидроэпиандростероном (r=0,183; p=0,004).

Нежелательные явления не отмечались.

Резюме основного результата исследования

Снижение уровня тестостерона при гипогонадизме и СД2 ассоциировано со снижением 17-гидроксипрогестерона, которое, в свою очередь, ассоциировано со снижением уровней других андрогенов.

Обсуждение основного результата исследования

Известным фактом являются различия в частоте встречаемости синдрома гипогонадизма у мужчин при СД2 — величина данного показателя варьирует от 15 до 80% [4][6][7][17][18]. Это обусловлено степенью компенсации углеводного обмена, выраженностью ожирения, возрастом пациентов, а также методом определения тестостерона в крови и используемыми критериями постановки диагноза [13][16][19]. Выявленная в нашей работе ассоциация гипогонадизма с ожирением была неоднократно подтверждена в различных исследованиях и обусловлена функциональным нарушением отрицательной обратной связи в системе гипоталамус-гипофиз-яички [4][8][20–22]. Причины этого могут быть различными. В ранних исследованиях была установлена неадекватно низкая секреция гонадотропинов при введении гонадотропин-рилизинг-гормона мужчинам с СД2 и ожирением [23]. Кроме того, гипогонадизм может развиваться из-за резистентности центральных гипоталамо-гипофизарных структур к лептину при ожирении, а также из-за избытка эстрогенов, образующихся в жировой ткани, что приводит к нарушению секреции гонадотропин-рилизинг-гормона и гонадотропинов [24][25]. Функциональное подавление регуляторных гормонов под действием вышеописанных факторов приводит к снижению их стимулирующего влияния на стероидогенез в клетках Лейдига. Таким образом, угнетается тестикулярный стероидогенез, но не затрагивается продукция стероидных гормонов надпочечниками. Это подтверждается полученными нами результатами, согласно которым у мужчин с СД2 и ожирением с гипо- и эугонадизмомом не были выявлены отклонения в показателях минералокортикоидного и глюкокортикоидного звеньев надпочечникового стероидогенеза. Однако учитывая имеющиеся литературные данные о влиянии инсулинорезистентности и ожирения на повышение уровня альдостерона и кортизола [26][27], для более детального изучения влияния нарушения углеводного обмена на надпочечниковый стероидогенез требуется проведение дополнительных исследований. Основным регулятором тестикулярного стероидогенеза в клетках Лейдига является лютеинизирующий гормон, воздействующий на мембранный рецептор, связанный с G-белком, и запускающий каскад реакций с последующей активацией протеинкиназы А [9][10]. Протеинкиназа А является триггером рядя внутриклеточных процессов, в результате которых холестерол поступает из липидных капель в митохондрии, а также происходит повышение экспрессии генов, кодирующих ферменты тестикулярного стероидогенеза [28–30]. Добавление аналога лютеинизирующего гормона — хорионического гонадотропина вызывало повышение экспрессии мРНК регуляторных генов тестикулярного стероидогенеза в обработанных клетках в несколько раз по сравнению с контрольными значениями [29]. На данный момент идет изучение внутриклеточных сигнальных путей и дополнительных регуляторных механизмов тестикулярного стероидогенеза, однако это затруднено низкой чувствительностью и специфичностью применяемых методик [28][30–32]. Учитывая сходную химическую структуру ключевых стероидных гормонов, их предшественников и метаболитов и трудности их дифференцированного определения стандартными иммуноферментными методами диагностики [11–13], на сегодняшний день оптимальным методом оценки компонентов стероидогенеза является ВЭЖХ-МС/МС, обеспечивающая высокую производительность, практически 100% селективность, необходимую чувствительность и воспроизводимость [13–15]. Так, в исследовании 2021 г. PIVUS, проведенном в Швеции с участием 452 70-летних внешне здоровых мужчин и определением с помощью ВЭЖХ-МС/МС стероидного профиля (прегненолон, 17-гидроксипрегненолон, 17-гидроксипрогестерон, 11-дезоксикортизол, дегидроэпиандростерон, андростендион, тестостерон, эстрон и эстрадиол), была подтверждена ассоциация низкого уровня тестостерона с ожирением: отмечались статистически значимо более низкие концентрации тестостерона и его предшественников (17-гидроксипрегненолона, 17-гидроксипрогестерона, андростендиона и дегидроэпиандростерона) у мужчин с ожирением по сравнению с лицами с нормальной и избыточной массой тела [33]. В нашем исследовании в группе мужчин с СД2 низкий уровень тестостерона также ассоциировался с более высоким ИМТ и сопровождался снижением концентрации предшественников андрогенов — 17-гидроксипрегненолона и 17-гидроксипрогестерона. При этом дополнительный корреляционный анализ продемонстрировал наиболее значимую положительную корреляцию концентрации тестостерона с 17-гидроксипрогестероном, который, в свою очередь, хоть и в меньшей степени, но также положительно коррелировал с более слабыми андрогенами — андростендионом и дегидроэпиандростероном. Таким образом, можно предположить, что 17-гидроксипрогестерон является маркером тестикулярного стероидогенеза. Наше предположение согласуется с результатами ряда исследований [34][35]. В работах продемонстрирована положительная корреляция между интратестикулярным тестостероном и сывороточным 17-гидроксипрогестероном у мужчин, получавших хорионический гонадотропин [34]. Основываясь на этом наблюдении, авторы выдвинули гипотезу о возможности использования 17-гидроксипрогестерона сыворотки крови в качестве маркера интратестикулярной продукции тестостерона у мужчин. Для проверки гипотезы было проведено проспективное исследование среди 140 мужчин, разделенных на 3 группы: получающие стимулирующую терапию цитратом кломифена и/или хорионическим гонадотропином человека; получающие заместительную экзогенную терапию препаратами тестостерона (ТЗТ), подавляющую внутритестикулярную продукцию тестостерона; и фертильные мужчины с нормальным уровнем тестостерона в сыворотке крови в качестве группы контроля. Уровень тестостерона был в пределах нормы в ходе исследования, в то время как 17-гидроксипрогестерон статистически значимо снизился у пациентов на ТЗТ и повысился у мужчин, получающих стимулирующую терапию кломифеном/гонадотропином. На основании этого исследователями был сделан вывод о надежности сывороточного 17-гидроксипрогестерона в качестве маркера интратестикулярной продукции тестостерона и возможности его потенциального использования при титрации/замене препаратов, влияющих на стероидогенез в клетках Лейдига [34]. Так, в недавних клинических исследованиях новой интраназальной формы тестостерона, позиционируемой авторами в качестве варианта ТЗТ с минимальным подавляющим влиянием на гипоталамо-гипофизарно-тестикулярную ось за счет короткого периода действия, нормальный уровень 17-гидроксипрогестерона на фоне терапии расценивался в качестве маркера сохранности тестикулярного стероидогенеза, минимального риска подавления сперматогенеза и возможности продолжения терапии тестостероном короткого действия. Низкий же уровень 17-гидроксипрогестерона указывал на супрессивное воздействие терапии [35]. Так как альтернативой по оценке выработки интратестикулярного тестостерона является инвазивная биопсия яичек, установление маркера, оцениваемого путем анализа крови, значительно упрощает задачи диагностики.

Ограничения исследования

Формирование выборки проводилось из пациентов, обратившихся в крупный федеральный медицинский центр, следовательно, выявленные особенности стероидогенеза могут отличаться в общей популяции мужчин с СД2, особенно с учетом влияния на эти показатели выраженности ожирения. Кроме того, полученные путем тандемной масс-спектрометрии данные не подлежат полной экстраполяции на другие методы определения стероидов у мужчин.

В нашем исследовании частота встречаемости гипогонадизма у мужчин с СД2 была определена высокоточным методом тандемной масс-спектрометрии и составила 69,5%. Развитие гипогонадизма у мужчин с СД2 было ассоциировано с ожирением. Не отмечено значимого влияния заболевания на минералкортикоидное и глюкокортикоидное звенья надпочечникового стероидогенеза. Гипогонадизм ассоциирован со снижением уровня ряда предшественников тестостерона. Наиболее значимым является 17-гидроксипрогестерон, который может рассматриваться как маркер тестикулярного стероидогенеза.

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке «Безен Хелскеа РУС» (Besins Healthcare RUS).

Конфликт интересов. Роживанов Р.В. — выплата гонораров от «Безен Хелскеа РУС» (Besins Healthcare RUS) в 2017–2022 гг. за чтение образовательных лекций, Чернова М.О. — конфликт интересов отсутствует, Иоутси В.А. — конфликт интересов отсутствует, Мельниченко Г.А. — выплата гонораров от «Безен Хелскеа РУС» (Besins Healthcare RUS) в 2017–2022 гг. за чтение образовательных лекций, Шестакова М.В. — конфликт интересов отсутствует, Мокрышева Н.Г. — конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов. Роживанов Р.В. — разработка концепции исследования, сбор и обработка научного материала, написание текста; Чернова М.О. — сбор и обработка научного материала, написание текста; Иоутси В.А. — сбор научного материала; Мельниченко Г.А. — разработка концепции исследования, редактирование текста; Шестакова М.В. — разработка концепции исследования, редактирование текста; Мокрышева Н.Г. — редактирование текста.

Благодарности. Авторы выражают благодарность пациентам, принявшим участие в исследовании.