Диагностика органического гиперинсулинизма у взрослых остается одной из наиболее трудных задач в практической эндокринологии. По данным многочисленных исследований, в том числе отечественных авторов [1][2], вариабельность клинических проявлений, а также дискордантность результатов топической диагностики приводят к поздней диагностике заболевания. В качестве вариантов совершенствования выявления инсулиномы предлагается комбинирование стандартных визуализирующих процедур [1], применение методов молекулярной визуализации [3], построение диагностических моделей на основе анализа панели генов-кандидатов [4]. Эти новые подходы, безусловно, являются наиболее перспективными для практического применения и, как следствие, наиболее обсуждаемыми в научной литературе последних лет. Однако поиск других, в том числе менее затратных методов, продолжается.

В настоящее время в свете выявления новых клеточных сигнальных путей [5][6] проводится активный поиск альтернативных иммуногистохимических (ИГХ) и циркулирующих маркеров (ЦМ) инсулиномы с целью определения злокачественного потенциала, прогнозирования рисков, изучения механизмов опухолевого роста и гормональной гиперсекреции. На основании полученных результатов также могут быть предложены молекулярные мишени для визуализации и лечения.

При анализе последних научных публикаций перспективными в качестве альтернативного маркера нейроэндокринных опухолей рассматриваются несколько кандидатов. Таким может являться опухолевый маркер кокаин- и амфетаминрегулируемый транскрипт (CART) [6], который экспрессируется в нейронах и нейроэндокринных клетках, а также был обнаружен в ткани феохромоцитомы, глюкагономы и инсулиномы [7][8]. CART увеличивает глюкозостимулированную секрецию инсулина in vivo у мышей и in vitro у человека, а также оказывает протективное действие в отношении бета-клеток против глюкотоксичности in vitro у крыс [9]. Есть предположительные данные, что высокодифференцированные инсулиномы, в отличие от менее дифференцированных, характеризуются высоким уровнем иммунореактивности к CART наравне с инсулином [10].

В качестве альтернативного онкомаркера при инсулиноме также может рассматриваться хромогранин В (ХрВ) [11][12]. Преимуществом ХрВ по сравнению с Хромогранином А является отсутствие влияния на его показатели нарушения функции почек и приема ингибиторов протонной помпы [12]. Согласно результатам отечественного исследования [9], частота повышения ХрВ при панкреатических нейроэндокринных опухолях (П-НЭО) составляет 68%. В отличие от Хромогранина А, значимых отличий в уровне ХрВ у пациентов с распространенными (с метастазами в печень) и локализованными формами заболевания не выявлено, что позволяет рассматривать его как универсальный и независимый маркер. Примечательно, что при нормальных показателях Хромогранина А у пациентов с П-НЭО и НЭО желудка в 53,6% случаев наблюдалось повышение концентрации ХрВ относительно порогового уровня [14].

Еще одним возможным биомаркером инсулиномы может быть NESP55 (нейроэндокринный секреторный протеин 55), который обнаружен в островках здоровой ткани поджелудочной железы (ПЖ), хромаффинных клетках, гипофизе и ткани феохромоцитомы, нейробластомы, инсулиномы и других П-НЭО. Согласно результатам отечественного исследования [15], иммунореактивность к данному протеину выявлена в 90,9% П-НЭО.

Предполагается, что в ткани низкодифференцированной инсулин-продуцирующей опухоли (О) ПЖ в процессе неопластической трансформации происходит потеря экспрессии протеина D52 (TPD52), который при иммуноокрашивании обнаруживается в островках Лангерганса (ОЛ) здоровой ткани ПЖ. При этом низкий уровень экспрессии TPD52 ассоциирован с агрессивным клиническим течением инсулиномы, уменьшением безрецидивной выживаемости и выживаемости, связанной с болезнью [16].

С целью уточнения механизмов канцерогенеза, а также определения молекулярных мишеней для визуализации О или радиотерапии большое значение имеет изучение экспрессии различных рецепторов в ткани инсулиномы. В частности, с учетом физиологической экспрессии в эндокринной части ПЖ рецепторов к глюкагоноподобному пептиду-1 (рГПП1), которые обнаружены и в клетках инсулиномы [17–19], преимущественно высокодифференцированной [17][19], разработаны соответствующие методы визуализации: ПЭТ/КТ и ОФЭКТ/КТ с радиотрейсерами на основе аналогов ГПП1. По данным литературы, инсулиномы могут секретировать ГПП-1 [20], однако оценка уровня циркулирующего гормона до и после хирургического лечения опухоли ранее не проводилась.

Кроме того, в клетках инсулиномы выявлены рецепторы к мелатонину MTNR1a и MTNR1b. В недавно проведенном исследовании [21] продемонстрировано, что в наномолярных концентрациях мелатонин стимулирует секрецию инсулина клетками инсулиномы крыс, воздействуя на MTNR1a и MTNR1b, однако при продолжительном воздействии — ингибирует, оказывая дозозависимый эффект. На животных моделях доказано ингибирующее влияние мелатонина на секрецию инсулина посредством воздействия на рецепторы MTNR1a [22], а также на транскрипцию гена инсулина посредством воздействия на рецепторы MTNR1b [23] инсулиномы. Как известно, в норме инсулин и мелатонин ингибируют секрецию друг друга [24]; а при сахарном диабете нарушается циркадный ритм секреции мелатонина [25], что, предположительно, обусловлено изменением активности фермента арилалкиламин-N-ацетилтрансферазы (AA-NAT), катализирующего синтез данного вещества [24]. Однако уровень мелатонина при инсулиноме не исследовался. Таким образом, предполагается, что изучение экспрессии рецепторов MTNR1a и MTNR1b с оценкой показателей мелатонина и фермента AA-NAT позволит выявить новые патогенетические механизмы влияния на функцию опухолевых бета-клеток, что впоследствии приведет к разработке новых терапевтических мишеней при данной О.

Целью настоящего исследования является поиск новых ИГХ и циркулирующих маркеров (ЦМ) инсулиномы, в том числе ее агрессивного течения.

Критерии включения: пол: мужской или женский. Возраст: 18 лет и старше. Диагноз: инсулин-продуцирующая опухоль (коды МКБ: С25.0–С25.4, С25.7–С25.8), выполнение хирургического вмешательства.

Критерии исключения: не применялись.

Источник случаев: пациенты, обследованные в ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» (НМИЦЭ) в период 2017–2022 гг.

Способ формирования выборки: сплошной.

Диагноз инсулиномы подтвержден результатами гистологического и ИГХ исследований. Рецидивом инсулиномы после операции с положительным исходом считается выявление гиперинсулинемической гипогликемии в сочетании со структурными изменениями ПЖ по данным визуализирующих исследований. При этом в качестве положительного исхода хирургического лечения рассматривалась ремиссия гипогликемического синдрома в раннем послеоперационном периоде по данным представленной медицинской документации. В качестве структурных изменений ПЖ, подтверждающих рецидив инсулиномы, рассматривались как новообразование в месте резекции1, так и новообразование другой локализации в рамках первично-множественного поражения2.

Инсулинома считалась агрессивной, если определялись промежуточная степень злокачественности G2 и выше [26] и/или первично-множественная инсулинома (число опухолей >1) любой степени злокачественности и/или рецидивирующая любой степени злокачественности3.

Дизайны исследований:

1)серия случаев с двухкратным наблюдением (до операции и при повторном визите через 2–12 месяцев после операции);

2)сравнительное (группы агрессивной и неагрессивной инсулиномы).

Исследование одобрено локальным этическим комитетом НМИЦЭ (протокол №1 от 27.01.2016 г.).

Перед операцией и на повторном визите после хирургического вмешательства всем пациентам выполнен забор крови в пробирки с активатором свертывания в одинаковых условиях искусственного освещения после 8–12 часов ночного голодания. Из венозной крови отделена сыворотка, заморожена и сохранена при температуре -80 °С.

Сбор серологического материала выполнялся исключительно в НМИЦЭ.

Сбор послеоперационного гистологического материала выполнялся в НМИЦЭ и в других медучреждениях, где выполнялось оперативное лечение.

ИФА исследование

Проведено исследование следующих циркулирующих маркеров: CART, ХрВ, NESP55, мелатонин, AA-NAT и у части пациентов (по техническим причинам) ГПП1.

Определение уровня мелатонина проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) на жидкостном хроматографе Agilent 1290 InfinityII (Agilent Technologies, Германия) и тандемном масс-спектрометре AB Sciex QTrap 5500 (AB Sciex, Сингапур) c источником ионизации TurboV (APCI).

ИФА и ВЭЖХ-МС/МС выполнялись в клинико-диагностической лаборатории НМИЦЭ.

Патоморфологическое и стандартное ИГХ исследования

Проводилась оценка числа инсулин-продуцирующих опухолей и их размера. При наличии нескольких опухолей приводилась характеристика наибольшей опухоли. Число митозов рассчитывалось на 10 полей зрения с объективом 40/0.65. В рамках стандартного ИГХ исследования производилось определение индекса пролиферативной активности (Ki67). Стадирование опухолей проводилось в соответствии с классификациями AJCC 2010 [27], ENETS/WHO 2010 [26]. Исследования выполнялись в отделе фундаментальной патоморфологии НМИЦЭ и других медучреждениях.

Расширенное ИГХ исследование

Выполнялось исследование О, окружающей ткани (ОТ) и островков Лангерганса (ОЛ) с первичными антителами к следующим белкам-маркерам: CART, ХрВ, NESP55, рГПП1, MTNR1b, TPD52. Исследованы образцы сыворотки некоторых (произвольно отобранных) пациентов до и после операции, выполненной в НМИЦЭ. Число образцов ткани для анализа было ограничено объемом имеющегося расходного материала. У одного пациента образцы ОТ и ОЛ отсутствовали для анализа в связи с исходным недостаточным объемом послеоперационного материала.

Исследование выполнялось в отделе фундаментальной патоморфологии НМИЦЭ.

Для проведения ИГХ исследования операционный материал фиксировали в забуференном формалине в течение 24 часов, проводили в изопропиловой гистологической проводке, заливали в парафин по стандартной методике. Иммуногистохимическое исследование проводилось на срезах толщиной 3 мкм, расположенных на стеклах с полилизиновым слоем (Leica, Германия) на полностью автоматизированном иммуногистостейнере LeicaBond III (Германия), позволяющем депарафинизировать срезы, проводить инкубацию с антителами при постоянной заданной температуре, проводить энзиматическую демаскировку антигенов, высокотемпературную демаскировку антигенов в буферах pH 6,0 и 8,8, подкрашивать препараты гематоксилином. Исследование проводилось по стандартным протоколам, рекомендованным фирмой-производителем с антителами, представленными выше. Все препараты были отсканированы на сканирующей системе LeicaAT2 (Германия) — уникальной системе получения высокоточных изображений гистологических препаратов, позволяющей создавать полноценное изображение, которое можно многократно увеличивать, просматривая отдельные фрагменты в высоком качестве. Программная обработка изображения позволяет проводить качественный и количественный анализ препарата.

С целью оценки специфичности взаимодействия антител с тканевыми антигенами использовали контрольные образцы: ткани надпочечника (для CART, ХрВ, NESP55), щитовидной железы (для MTNR1a4, MTNR1b, TPD52), ПЖ (для рецепторов к ГПП1), гипофиза (для ХрВ), предстательной железы (для TPD52). Интенсивность окрашивания описывали в соответствии со следующей системой: «−» (0 баллов) при отсутствии иммунореактивности, «+» (1 балл) при слабоположительной реакции (низкоинтенсивное), «++» (2 балла) при умеренно положительной реакции (умеренно интенсивное) и «+++» (3 балла) при выраженной положительной реакции иммуноокрашивания (высокоинтенсивное).

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием пакета STATISTICA v. 13 (TIBCO Inc., США). Распределения количественных признаков представлены медианами (Me) и интерквартильными интервалами [Q1; Q3], для некоторых признаков — также минимальными и максимальными значениями. Распределения качественных признаков представлены абсолютными и относительными частотами. Для сравнения связанных групп по количественным признакам применялся критерий Вилкоксона, для сравнения независимых групп по качественным признакам — двусторонний точный критерий Фишера (ТКФ2) и критерий Фримена-Холтона (КФХ, http://vassarstats.net/). Критический уровень статистической значимости был принят равным 0,05.

В исследование включен 41 пациент, их характеристика на момент операции и описание удаленных новообразований приведены в таблице 1. 13 пациентов прооперированы в НМИЦЭ, 28 — в других медучреждениях РФ. Все повторные визиты после операции прошли в НМИЦЭ.

Солитарная И наблюдалась в 83% случаев, 95% ДИ (68%, 93%), множественная — в 17% (7%, 32%). Доля небольших (до 2 см) опухолей составила 26/41=63%, 95% ДИ (47%; 78%). Низкую злокачественность (G1) имели опухоли у 61%, 95% (45%; 76%) пациентов. Ki-67%≥3 имели 39%, 95% ДИ (24%; 57%) пациентов. Длительность наблюдения после операции варьировала от 2 до 12 мес. У 9 (22%, 95% ДИ (11%; 38%)) пациентов определен рецидив в сроки от 4 до 12 мес. (рис. 1).

Агрессивная И установлена у 23 пациентов, неагрессивная — у 18.

Проведен сравнительный анализ значений ЦМ до операции и через 2–12 мес после оперативного вмешательства, а также в группах с агрессивной и неагрессивной инсулиномой (табл. 2).

Cтатистически значимых различий не выявлено. Динамика индивидуального уровня всех ЦМ после операции была разнонаправленной — отмечено как снижение, так и повышение показателей.

Расширенные ИГХ исследования выполнены у 10 пациентов (табл. 3).

Во всех О зафиксирована экспрессия маркеров: ХрВ (2–3 балла), NESP55 (1–2 балла), TPD52 (1–3 балла), рГПП1 (1–3 балла). Маркеры CART и MTNR1b экспрессировались не во всех О.

Маркер CART не экспрессировался, а NESP55 не всегда экспрессировался в ОТ и в ОЛ, при этом степень экспрессии составляла всегда не более 1 балла. рГПП1 не экспрессировались в ОТ, но всегда в ОЛ (2 балла). MTNR1b не экспрессировались в ОТ, но в ряде случаев выявлялись в ОЛ. Всегда отмечалась экспрессия в ОТ и ОЛ TPD52 и ХрВ: 1–2 балла и 2–3 балла, соответственно. Таким образом, TPD52 и ХрВ экспрессировались везде (в О, ОТ и ОЛ), причем, если для ХрВ более интенсивная экспрессия отмечалась в О, то для TPD52 она не имела каких-то либо особенностей по локализации. Маркер NESP55 в ряде случаев экспрессировался в ОТ и в ОЛ, но всегда в О. Экспрессия CART была ассоциирована только с О (в 4/10 случаев), а MTNR1b и рГПП1 с О (в 6/10 и 10/10 соответственно) и ОЛ (в 5/9 и 9/9 соответственно). Таким образом, CART, MTNR1b и рГПП1экспрессировались в О и ОЛ, но не в ОТ (0%, 95% ДИ (0%; 31%)). Экспрессия CART, MTNR1b и рГПП1 в О представлена на рисунках 2–4.

При сопоставлении особенностей опухоли с наличием/интенсивностью экспрессии изучаемых маркеров обнаружено, что только при множественной инсулиноме (n=2) маркер NESP55 никогда не экспрессировался в ОТ и ОЛ, а CART никогда не экспрессировался в О; экспрессия маркеров ХрВ в О составляла 3, а экспрессия маркеров ХрВ и TPD52 в ОТ и ОЛ одинаково для каждого маркера составляла 3 и 2 балла соответственно. При рецидивирующей инсулиноме (n=2) экспрессия маркера ХрВ в О составляла 2 балла. При рецидивирующей и множественной инсулиноме экспрессия маркеров NESP55 и TPD52 в О составляла 1 балл.

С учетом полученных результатов проведен поиск взаимосвязи между наличием экспрессии маркера, интенсивностью окрашивания (в баллах), локализацией экспрессии и агрессивностью инсулиномы (табл. 4).

По результатам анализа, значимого предиктора агрессивной инсулиномы не выявлено.

Проведен сравнительный анализ до- и послеоперационного (через 2–11 месяцев) уровня ЦМ у 10 пациентов с экспрессией соответствующего маркера в О (табл. 5).

Изменения уровня ЦМ после проведения хирургического вмешательства не обнаружены.

Полученные результаты согласуются с данными других авторов в отношении возраста манифестации инсулиномы, преобладания пациентов женского пола [28] и медианы размера О [29]. Множественная инсулинома наблюдалась с той же частотой, что и в других исследованиях: 17% (7%; 32%) в нашем исследовании, 10,3% [28] и 8% [29] случаев. В отличие от работ Crippa S et al. [29], а также Iglesias P et al. [28], не отмечалось преобладание О класса G1, однако, в отличие от выборки Wu H. et al. [30], в обследованной нами когорте чаще встречались О с Ki-67 ≥3% (39% против 11,1%). Наиболее вероятно, именно эта особенность обусловливает относительно высокую частоту рецидивов в нашем исследовании (так, в работах Hasanov R. et al. [31] и Crippa S et al. [29] этот показатель составил 14,2% и 3% соответственно). Не исключается также, что более высокая выявляемость рецидивов в нашем исследовании объясняется применением высокочувствительных инструментальных методов диагностики.

Мы впервые оценили возможность применения в качестве опухолевых маркеров CART, ХрВ, NESP55, TPD52, MTNR1b, мелатонина, AA-NAT, рГПП1, цГПП1 исключительно в выборке пациентов с инсулиномой, а не в когорте больных с различными НЭО, как в других работах. При этом изучение большинства маркеров проводилось как в послеоперационном материале, так и в образцах сыворотки до и после операции. Более того, нами впервые исследованы уровни цМелатонина, AA-NAT и цГПП1 у пациентов с инсулиномой.

Значимого ИГХ предиктора агрессивной инсулиномы не выявлено, и это, возможно, связано с малыми выборками в нашем исследовании. Но в случаях, когда у всех пациентов присутствовал только какой-либо один признак, а другой полностью отсутствовал (т.е. результат равнялся нулю), мы позволили себе высказывать предположения о возможном наличии ассоциации этой особенности с агрессивным/неагрессивным течением заболевания. Небольшим числом участников, включенных в исследование, возможно, объясняется и отсутствие значимых отличий в уровне циркулирующих маркеров до и после операции, даже при условии их экспрессии в ткани опухоли.

Экспрессия CART в нашем исследовании выявлена только в ткани О и только в некоторых образцах (в 40% случаев — все с солитарной инсулиномой), в отличие от условно здоровых лиц без инсулиномы и больных СД2 в ранее опубликованном исследовании [32], у которых определялась экспрессия CART в ОЛ. Возможно, этот признак является особенностью пациентов с инсулин-продуцирующими О.

Мы показали, что уровень цCARTу пациентов с экспрессией маркера в ткани О значимо не менялся после хирургического лечения, однако у всех пациентов отмечено его снижение, в т.ч. у пациента с рецидивом заболевания. В перспективе при увеличении выборки пациентов с экспрессией CART в ткани О мы предполагаем, что возможно и определение диагностического порога для данного ЦМ. В пользу этого предположения свидетельствуют и данные Bech PR et al. [6], которые выявили повышение цCART в 95% случаев прогрессирующих П-НЭО (всего обследовано 20 больных). Однако, так как авторы не указывают, какие по гормональной активности П-НЭО вошли в выборку, эти данные следует интерпретировать с осторожностью.

Согласно данным литературы [33], ХрВ играет важную роль в регуляции транспорта секреторных гранул в β-клетках. Потеря его экспрессии приводит к нарушению глюкозозависимой секреции инсулина и процессинга проинсулина с увеличением его высвобождения. В нашей работе, как и в исследованиях других авторов, была подтверждена экспрессия маркера в ОЛ [34], при этом для неагрессивной инсулиномы обнаружена выраженная экспрессия как в ОЛ, так и в ОТ. Данный маркер мы выявили во всех образцах О, но в качестве ЦМ результаты получены неоднозначные. Необходимо отметить, что информация из литературных источников об экспрессии в П-НЭО ХрВ противоречива: так, Sekiya K. et al. [35] обнаружили этот маркер в 4 из 9 образцов инсулином, тогда как Kimuro N. et al. [36] — напротив, не выявили экспрессию ни в одной П-НЭО, включая 8 инсулином. Наиболее вероятно, расхождения в результатах обусловлены использованием различных наборов антител или особенностями конкретных опухолей.

В ранее опубликованных работах сообщалось об экспрессии NESP55 в ОЛ ПЖ [37], а также в ткани инсулиномы, в т.ч. метастатической [38]. Нами подтверждена экспрессия NESP55 в ОЛ ПЖ при солитарной инсулиноме, а также в ткани О. Необходимо отметить, что маркер выявлен во всех образцах О. Однако, в отличие от Jakobsen A-M. et al. [38], в исследованных нами образцах данный маркер также выявлен в ОТ ПЖ при солитарной инсулиноме. Таким образом, в отношении данного маркера также получены неоднозначные результаты.

Как и в работах других авторов, нами подтверждена экспрессия маркера в ОЛ ПЖ, а также ассоциация более низкого уровня (1–2 балла) экспрессии TPD52 в О с ее агрессивным течением [16][26]. Но поскольку маркер экспрессировался и в ОТ, его ассоциация с инсулиномой остается сомнительной.

Нами также подтверждена экспрессия рГПП1 в ОЛ (не всегда) и в ткани О [39–45]. В обследованной нами когорте обращает на себя внимание отсутствие высокоинтенсивного окрашивания на рГПП1 при неагрессивной инсулиноме. В то же время, согласно данным литературы, экспрессия рГПП1 является признаком преимущественно неагрессивных опухолей, хотя степень экспрессии в этом исследовании не уточняется [17].

Учитывая отсутствие значимого изменения уровня цГПП1 после операции как в изучаемой группе 41 пациента, так и у пациентов с доказанной экспрессией его рецептора в О, можно сделать вывод, что наличие инсулиномы не влияет на секрецию ГПП1.

Согласно полученным результатам, экспрессия MTNR1b выявлена нами в 60% образцов О и в 56% образцов ОЛ, что подтверждает данные ранее опубликованных исследований [23][46]. Значимых отличий уровня цМелатонина (как и уровня цАA-NAT) у пациентов с агрессивной и неагрессивной инсулиномой не выявлено. Таким образом, возможно, данный гормон не играет патогенетической роли при инсулиноме.

Таким образом, мы выявили перспективные опухолевые маркеры (CART, MTNR1b и рГПП1), которые требуют дальнейшего изучения. Согласно полученным результатам, прочие маркеры (TPD52, ХрВ, NESP55, мелатонин, AA-NAT) не отличаются селективностью в отношении инсулиномы. В силу малой выборки пациентов, полученные данные носят предположительный характер, необходимо увеличение исследуемой популяции, а также более широкая линейка как потенциальных иммуногистохимических маркеров инсулиномы, так и соответствующих им циркулирующих.

Впервые исключительно на выборке пациентов с инсулиномой исследованы маркеры CART, ХрВ, NESP55, TPD52, MTNR1b, мелатонин, рГПП1, цCART, цХрВ, цNESP55, цAA-NAT, цГПП1.

CART экспрессировался только в О, а рГПП1 и MTNR1b — в О и ОЛ, но не в ОТ, в связи с чем именно данные маркеры представляют значительный интерес для дальнейшего изучения на большей выборке пациентов. Другие маркеры не отличались селективностью (TPD52, ХрВ, NESP55 экспрессировались не только в О и ОЛ, но и в ОТ; уровни мелатонина и AA-NAT, как и остальные ЦМ, значимо не менялись у пациентов до и после оперативного вмешательства), что делает их неперспективными в отношении изучения при инсулин-продуцирующей опухоли. Требуется проведение исследований, направленных на поиск новых как циркулирующих, так и ИГХ маркеров, с целью ранней диагностики манифестации заболевания и его рецидива, более точного определения злокачественного и пролиферативного потенциала опухоли.

Финансирование. Исследование выполнено при поддержке гранта Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение № 075–15–2022–310 от 20.04.2022).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Вклад авторов. Юкина М.Ю. — анализ литературных данных; разработка концепции и дизайна исследования; проведение обследования пациентов; сбор материала; участие в проведении лабораторных исследований; получение, анализ и интерпретация результатов; написание статьи; Трошина Е.А. — помощь в разработке концепции и дизайна исследования; внесение в рукопись существенной (важной) правки с целью повышения научной ценности статьи; одобрение финальной версии рукописи; Урусова Л.С. — помощь в проведении патоморфологических и иммуногистохимических исследований; Нуралиева Н.Ф. — помощь в сборе материала; подготовка статьи к публикации; Иоутси В.А. — помощь в исследовании уровня мелатонина; Никанкина Л.В. — помощь в проведении прочих лабораторных исследований; Реброва О.Ю. — внесение существенной (важной) правки в анализ и интерпретацию результатов; Мокрышева Н.Г. — внесение в рукопись существенной (важной) правки с целью повышения научной ценности статьи, одобрение финальной версии рукописи.

Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.

1. При этом данных за наличие опухоли в крае резекции по результатам патоморфологического исследования после первичной операции не было. В противном случае состояние расценивалось как «продолженный рост опухоли или нерадикальность хирургического вмешательства». 2. В нашем исследовании у всех пациентов рецидив заболевания впервые установлен в ходе повторного визита через 2–12 месяцев после операции. 3. Это не общепринятая схема оценки. Поскольку известно, что даже высокодифференцированная опухоль Grade 1 не может гарантировать благоприятный прогноз и отсутствие метастазирования, мы добавили дополнительные критерии, помимо Grade. Эти дополнительные критерии, по нашему мнению, в большей степени осложняют течение заболевания/препятствуют ремиссии, а метастатической инсулиномы в нашей когорте не было. 4. Экспрессия MTNR1а не подтверждена на контрольных образцах, дальнейшие исследования с данным маркером не проводились.