Синдром множественных эндокринных неоплазий 1-го типа (МЭН-1), проявляющийся сочетанным развитием первичного гиперпаратиреоза (ПГПТ), аденом гипофиза (АГ) и нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы (НЭО ПЖ), возникает в результате герминальных мутаций в гене-супрессоре опухолевого роста MEN1. Клинический диагноз синдрома основывается на сочетании минимум двух из трех вышеперечисленных опухолей и должен быть подтвержден результатами молекулярно-генетического исследования [1].

В 10—30% семейных случаев МЭН-1 и до 90% спорадических случаев этого синдрома мутации в гене MEN1 методом прямого секвенирования по Сэнгеру не выявляются [2]. Синдром МЭН-1, диагностированный по клиническим признакам, но без выявленной мутации в гене MEN1, обозначается как фенокопия синдрома МЭН-1 [3—5]. Таким образом, с помощью молекулярно-генетического исследования можно подтвердить диагноз фенокопии синдрома МЭН-1 у пациента. В соответствии с существующими международными рекомендациями, отсутствие мутации в гене MEN1 исключает необходимость ежегодного скрининга с целью раннего выявления оставшихся компонентов синдрома у пациента и риск заболевания у родственников первой линии родства [1]. Однако могут иметь место мутации в некодирующих областях гена MEN1, крупные делеции гена или мутации в других, еще не установленных, генах [1].

Примерно в половине спорадических случаев МЭН-1 наблюдается сочетание АГ и ПГПТ; частота герминальных мутаций в гене MEN1 при таком сочетании в среднем составляет около 7%, что значительно ниже, чем при семейном МЭН-1 [2]. Примечательно, что у фенокопий МЭН-1 с сочетанием АГ и ПГПТ в подавляющем большинстве случаев встречаются соматотропиномы, а не пролактиномы, как при истинном МЭН-1 с мутацией в гене MEN1 [2, 6]. Кроме того, пациенты с фенокопиями МЭН-1 обычно старше пациентов с истинным МЭН-1 [2, 6]. При спорадическом сочетании АГ и НЭО ПЖ частота герминальных мутаций в гене MEN1 также составляет около 7% [2].

Механизмы возникновения фенокопий МЭН-1 изучены недостаточно. Сочетанное развитие АГ и ПГПТ (и/или НЭО ПЖ) может объясняться следующими причинами: 1) мутациями в генах (возможно, еще неизученных), приводящими к одновременному развитию АГ и ПГПТ (и/или НЭО ПЖ);  2) мутациями в генах, приводящими к семейным формам АГ, при сочетании со спорадическим ПГПТ (и/или НЭО ПЖ) или мутациями в генах, приводящими к семейным формам ПГПТ, при сочетании со спорадическими АГ (и/или НЭО ПЖ); 3) бигенным заболеванием, когда у одного и того же пациента или одной семьи имеются мутации в двух генах, приводящие к развитию семейных форм АГ и семейных форм ПГПТ; 4) развитием АГ и ПГПТ (и/или НЭО ПЖ) у одного и того же пациента вследствие случайного спорадического сочетания. Исключение наследственной природы сочетания нескольких эндокринных неоплазий крайне важно для определения тактики ведения пациента и обследования родственников первой линии родства.

Цель исследования — определить роль генов, ассоциированных с развитием наследственных АГ, а также генов, возможно вовлеченных в патогенез спорадических АГ, в развитии фенокопий синдрома МЭН-1, одним из компонентов которых является АГ.

В исследование были включены 23 пациента с клиническим диагнозом синдрома МЭН-1, наблюдавшихся в отделении нейроэндокринологии и остеопатий ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России. С учетом цели исследования, одним из компонентов синдрома МЭН-1 у 22 пациентов была АГ. В исследование была включена также 1 пациентка с краниофарингиомой, что обосновывалось наличием у нее двух других компонентов синдрома МЭН-1 (ПГПТ и НЭО ПЖ), а также особенностью эмбрионального развития краниофарингиомы из клеток-предшественников аденогипофиза. Кроме того, у 1 пациентки имело место не классическое для МЭН-1 сочетание опухолей, а сочетание АГ и феохромоцитомы. Диагнозы АГ, ПГПТ и НЭО ПЖ установливались в соответствии со стандартными алгоритмами [1]. Во всех случаях отсутствовали надежные данные о наличии АГ, ПГПТ, НЭО ПЖ или синдрома МЭН-1 у родственников первой линии родства. Критерием исключения являлись выявленные ранее секвенированием по Сэнгеру мутации в гене MEN1. Все пациенты подписывали информированное согласие на участие в исследовании.

Молекулярно-генетическое исследование

Всем пациентам было проведено исследование панели генов-кандидатов, включающей гены, герминальные мутации в которых могут приводить к развитию наследственных АГ (MEN1, CDKN1B, PRKAR1A, AIP); гены, мутации в которых могут приводить к сочетанному образованию АГ и феохромоцитом/параганглиом (SDHA, SDHB, SDHC, SDHD), а также некоторые гены, в которых были выявлены соматические мутации, или изменение экспрессии которых было зафиксировано в тканях спорадических АГ (GNAS, PRKCA, CDKN2A, CDKN2C, POU1F1, PTTG2) [7]. Панель праймеров для мультиплексной амплификации вышеперечисленных генов (207 ампликонов) была создана с помощью программы Ion AmpliSeqTM Designer (https://www.ampliseq.com). Геномная ДНК была выделена из цельной крови с использованием набора MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (Roche Diagnostics, Швейцария) с помощью MagNA Pure LC 2.0 Instrument («Roche Diagnostics», Швейцария). В дальнейшем были проведены этапы подготовки проб перед высокопроизводительным параллельным секвенированием (next-generation sequencing — NGS) и собственно NGS на секвенаторе Ion TorrentTM PGMTM (Thermo Fisher Scientific — Life Technologies, США) в соответствии со стандартными протоколами (доступны на сайте https://ioncommunity.thermofisher.com/community/protocols-home или по запросу). Анализ данных NGS проводился с помощью программного обеспечения Torrent SuiteTM (Thermo Fisher Scientific — Life Technologies, США). Аннотирование выявленных изменений проводилось с помощью программы ANNOVAR (http://annovar.openbioinformatics.org) [8]. В качестве референсной последовательности генов MEN1, CDKN1B, PRKAR1A, AIP, SDHA, SDHB, SDHC, SDHD, GNAS, PRKCA, CDKN2A, CDKN2C, POU1F1, PTTG2 использовалась ссылка Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) под номерами NM_130799.2, NM_004064.4, NM_002734.4, NM_003977.3, NM_004168.3, NM_003000.2, NM_003001.3, NM_003002.3, NM_000516.4, NM_002737.2, NM_000077.4, NM_001262.2, NM_000306.3, NM_006607 соответственно.

Клинические характеристики пациентов представлены в таблице. Среди пациентов преобладали женщины (соотношение 10:1). У большинства пациентов (n=20) имелось сочетание АГ и ПГПТ, у 1 пациентки (№23) — сочетание краниофарингиомы, ПГПТ и НЭО ПЖ, у 1 пациента (№14) — АГ и НЭО ПЖ, у 1 пациентки (№22) — АГ и феохромоцитомы правого надпочечника.

Клиническая характеристика пациентов с фенокопиями синдрома МЭН-1

Примечание. *Указаны: тип секреции; размер и характер роста; наличие ремиссии; возраст на момент дебюта/выявления (годы). ** Указаны: наличие (+ есть, – нет); возраст на момент дебюта/выявления (годы). ^ Пациенты с НЭО ПЖ. ~ Пациентка с феохромоцитомой правого надпочечника. ° См. объяснение в тексте.

Сокращения: СТГ — соматотропный гормон; ПРЛ — пролактин; АКТГ — аденокортикотропный гормон; ГНАГ — гормональнонеактивная АГ; микро- — микроаденома; макро- — макроаденома; характер роста: (э) — эндоселлярный, (п) — параселлярный (D — в правый кавернозный синус, S — в левый кавернозный минус), (р) — ретроселлярный, (и) — инфраселлярный, (а) — антеселлярный; АС — аналоги соматостатина длительного действия; АД — агонисты дофамина; Р — ремиссия; МР — медикаментозная ремиссия; НР — нет ремиссии; ТТА — трансназальная транссфеноидальная аденомэктомия; ТКА — транскраниальная аденомэктомия; ГТ — гамма-терапия; ЛТ — лучевая терапия (Novalis); НО — не оперирован.

Аденомы гипофиза

Среди АГ преобладали соматотропиномы (n=16; 73%); остальные типы АГ были представлены единичными случаями: смешанная СТГ/ПРЛ-секретирующая АГ — 2 (9%), пролактинома — 1 (4,5%), кортикотропинома — 2 (9%), гормональнонеактивная АГ (ГНАГ) — 1 (4,5%). Информация о типе секреции, характере роста АГ, проведенном лечении, наличии ремиссии и возрасте дебюта АГ представлена в таблице. АГ были первым клиническим проявлением у 20 (91%) пациентов. У пациентки №23 первым клиническим проявлением была краниофарингиома. Дебютом заболевания считали возраст появления клинических признаков АГ или их выявления АГ (при отсутствии клинических признаков).

Первичный гиперпаратиреоз

ПГПТ был диагностирован у 21 из 23 пациентов на основании минимум двукратного определения повышенного уровня кальция и паратгормона (ПТГ) в крови. В большинстве случаев ПГПТ диагностировался позже АГ (90%). У 2 пациенток (№1 и №13) ПГПТ был выявлен раньше АГ (при обследовании по поводу мочекаменной болезни). У пациентки №13 мочекаменная болезнь дебютировала в 25 лет, однако диагноз ПГПТ был установлен лишь в возрасте 57 лет.

Нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы

У 2 пациентов были клинически диагностированы гормональнонеактивные НЭО ПЖ. У пациентки №23 имелось сочетание краниофарингиомы, ПГПТ и НЭО ПЖ. С помощью мультиспиральной компьютерной томографии (МСКТ) в хвосте ПЖ было выявлено гиперваскуляризованное образование размером 1,3×1,2×1,5 см, в теле железы — гиперваскуляризованное образование размером 0,6×0,6×0,8 см (по характеристикам контрастного усиления, наиболее вероятно — НЭО). У пациента №7 при МСКТ в хвосте ПЖ было выявлено объемное образование низкой плотности диаметром 2,4 см, состоящее из мягкотканного и кистозного компонента. Была проведена корпорокаудальная резекция ПЖ (60%), спленэктомия, холецистэктомия (гистологически — серозная микрокистозная аденома диаметром 2 см и нейроэндокринная микроаденома диаметром 5 мм).

Феохромоцитома и другие опухоли

У пациентки №22, по данным МСКТ забрюшинного пространства, имелось объемное образование кистозно-солидной структуры правого надпочечника (3,2×3,3×3,6 см, плотность 36 НU) и образование левого надпочечника (0,86×0,87 см, плотность 11 НU). В моче выявлено повышение уровня метанефрина — 1647 мкг/сут (норма 25—312 мкг/сут), норметанефрина — 604 мкг/сут (норма 35— 445 мкг/сут), что подтверждало диагноз феохромоцитомы (вероятно, правого надпочечника, поскольку эта опухоль имела большие размеры и высокую плотность, тогда как образование левого надпочечника представляло собой скорее гормональнонеактивную опухоль). У некоторых пациентов имелись также другие эндокринные и неэндокринные новообразования: рак молочной железы (№1), рак почки (№12), злокачественная опухоль забрюшинного пространства (№20), гемангиома кожи стопы (№3), гемангиома тела поясничного позвонка (№17), липомы кожи (№14), опухоль яичника (№13), ангиолипома почки (№6), одно- и двусторонние гормональнонеактивные опухоли надпочечников (№2, 5, 6, 14, 17, 20), макронодулярная гиперплазия надпочечников (№11).

Молекулярно-генетическое исследование

По данным NGS, ни у одного из пациентов мутации в гене MEN1 выявлены не были, что подтверждает диагноз фенокопий синдрома МЭН-1.  У 1 пациентки (№13) с макросоматотропиномой и висцеральной формой ПГПТ была выявлена герминальная гетерозиготная замена (миссенс-мутация) в экзоне 6 гена AIP c.911G>A (p.R304Q).

У 4 пациентов были выявлены полиморфизмы, патологическая значимость которых не определена: у пациентки №17 с макросоматотропиномой и костно-висцеральной формой ПГПТ — гетерозиготная замена p.R45H (c.134G>A) в экзоне 1 гена PTTG2, у пациентки №20 с ГНАГ и костно-висцеральной формой ПГПТ — гетерозиготная замена в интроне 1 гена PRKAR1A (c.-10G>C), у пациентки № 6 с микросоматотропиномой и мягкой формой ПГПТ — гетерозиготная замена в экзоне 5 гена SDHB p.S163P (c.487T>C), у пациентки №10 с макросоматотропиномой и мягкой формой ПГПТ — гетерозиготная замена в 3’-UTR генаCDKN1B g.3897G>T (c*8G>T).

АГ могут развиваться в рамках некоторых наследственных синдромов, к которым, помимо синдрома МЭН-1, относят синдром множественных эндокринных неоплазий 4-го типа (МЭН-4), Карни комплекс (CNC), семейные изолированные аденомы гипофиза (FIPA) [7, 9]. Указанные синдромы развиваются вследствие герминальных мутаций в генах CDKN1B, PRKAR1A и AIP соответственно [7, 9]. Следует отметить, что герминальные мутации в гене AIP выявляются только в 10% случаев FIPA, причина развития остальных FIPA до настоящего времени не установлена [10].

Синдромы семейных параганглиом/феохромоцитом типов 5, 4, 3 и 1 обусловлены мутациями в генах, кодирующих 4 субъединицы митохондриального комплекса сукцинатдегидрогеназы (SDHA, SDHB, SDHC и SDHD), соответственно. Показано, что мутации в этих генах иногда выявляются у пациентов с сочетанием АГ и параганглиом/феохромоцитом, что делает вероятным их участие в формировании АГ [11, 12]. В последнее время описано несколько пациентов с мутациями в гене рибонуклеазы — DICER1 (преимущественно дети с болезнью Кушинга вследствие бластом/аденом гипофиза, плевропульмональными бластомами и другими опухолями), однако роль таких мутаций в формировании АГ изучена мало [7, 9]. Подробное описание перечисленных наследственных синдромов выходит за рамки данной статьи; детальная информация представлена в ряде отечественных и зарубежных публикаций [7, 9—12].

При исследовании спорадических АГ были выявлены как соматические мутации в некоторых генах (GNAS, PRKCA, MEN1 и др.), так и изменения экспрессии ряда генов в ткани АГ (PRKCA, CDKN2A, CDKN2C, POU1F1 и др.), однако неясно являются ли они триггером образования АГ или возникают позднее уже в ткани АГ [7].

В нашем исследовании только у 1 (4%) из 23 пациентов с фенокопиями МЭН-1 была обнаружена герминальная гетерозиготная замена (возможно, миссенс-мутация) в гене AIP. Выявленная замена p.R304Q описана ранее у пациентки из Польши со спорадической кортикотропиномой, манифестировавшей в возрасте 26 лет [13]. Доказательство патогенности миссенс-мутаций всегда представляет трудности, однако выявленная нами мутация может считаться патогенной по нескольким алгоритмам in silico. Распространенность указанной мутации в популяции неизвестна. Примечательно, что в литературе была описана мутация со сдвигом рамки считывания в гене AIP (c.825_845delCGCGGCCGTGTGGAATGCCCA, p.His275GlnfsX49) у пациента с акромегалией, диагностированной в 23 года, и ПГПТ, диагностированным в 29 лет, по поводу которого было удалено солитарное образование околощитовидной железы [14]. Кроме того, описаны герминальные миссенс-мутации (возможно, полиморфизмы) в гене AIP у пациенток пожилого возраста со спорадическим ПГПТ без АГ [15]. Таким образом, выявленная нами гетерозиготная замена в гене AIP может рассматриваться либо как причина FIPA в сочетании со спорадическим ПГПТ, либо как причина и соматотропиномы и ПГПТ, либо как полиморфизм. В дальнейшем планируется обследование родственников первой линии родства пациентки №11 для выявления носителей мутации и определения их фенотипических проявлений.

Выявленная гетерозиготная замена p.R45H (c.134G>A) в экзоне 1 гена PTTG2 у пациентки №17 предсказана полиморфизмом по нескольким in silico алгоритмам. Кроме того, аргинин в положении 45 не является консервативным. Ген PTTG2 входит в семью генов PTTG (pituitary tumor transforming genes), включающую также гены PTTG1 и PTTG3, которые относятся к семейству секуринов, необходимых для регуляции расхождения сестринских хроматид во время митоза. Можно ожидать повышения экспрессии PTTG в опухолях различных типов. В ряде исследований установлено, что уровень мРНК PTTG в соматотропиномах выше, чем в ГНАГ, но в кортикотропиномах, пролактиномах и соматотропиномах статистически не различаются. Также показано, что экспрессия PTTG в гормональноактивных инвазивных АГ выше, чем в их неинвазивных аналогах [16]. Пациентка №17 характеризовалась рядом особенностей. Помимо АГ и ПГПТ, у нее имелись аденокарцинома правой почки и многоузловой токсический зоб, двусторонние гормональнонеактивные образования надпочечников, гемангиомы тела L3, кисты левой почки. В раннем послеоперационном периоде после трансназальной транссфеноидальной аденомэктомии, по поводу макросоматотропиномы, у нее развились клинические признаки надпочечниковой недостаточности (выраженная слабость, отсутствие аппетита, тошнота, рвота, гипотония); при этом в крови отмечалось парадоксальное повышение утреннего кортизола  (> 1750 нмоль/л при норме 123—626 нмоль/л) и кортизола в вечерней слюне (121,9 нмоль/л; норма 0,5—9,4 нмоль/л) на фоне нормальной концентрации АКТГ (47,9 пг/мл), гипокалиемия (2,5 ммоль/л при норме 3,5—5,1 ммоль/л) и значительное снижение почечной функции (скорость клубочковой фильтрации — 30 мл/мин/1,73 м2). После внутримышечного введения препаратов глюкокортикоидов самочувствие пациентки значительно улучшилось.

В настоящее время описано около 10 сплайсинговых мутаций в гене PRKAR1A, преимущественно у пациентов с Карни комплексом, а также синдромом Кушинга вследствие первичной пигментной нодулярной гиперплазии коры надпочечников [17].  В нашем исследовании гетерозиготная замена в интроне 1 гена PRKAR1A (c.-10G>C) была выявлена у пациентки с гормональнонеактивной эндопараинфраселлярной макроаденомой гипофиза, костной формой ПГПТ и гормональнонеактивным образованием правого надпочечника. В анамнезе пациентки артериальная гипертензия кризового течения с 36 лет, объемное образование левого надпочечника, по поводу которого в возрасте 47 лет проведена левосторонняя адреналэктомия (гистологическое заключение: аденоматозная ткань, гормональные исследования перед операцией не проводились), а также злокачественная опухоль забрюшинного пространства, по поводу которой проведены экстирпация матки с правым придатком, экстирпация прямой кишки с забрюшинной опухолью (результаты гистологического заключения не предоставлены).

Гетерозиготная замена в гене SDHB p.S163P (c.487T>C), обнаруженная у пациентки с микросоматотропиномой и мягкой формой ПГПТ, встречается в европейской популяции с частотой 1,7%. Такая замена описана как полиморфизм у пациента с медуллярным раком щитовидной железы [18]. Герминальные мутации в гене SDHB приводят к развитию синдрома семейных параганглиом/феохромоцитом типа 4. К 2015 г. описано 6 пациентов с мутациями в гене SDHB, у которых АГ сочетались с феохромоцитомами/параганглиомами [11]. Примечательно, что у пациентки №22 с акромегалией и феохромоцитомой правого надпочечника мутации в генах SDHA, SDHB, SDHC, SDHD не были обнаружены.

Ни у одного из пациентов с фенокопиями МЭН-1 мы не выявили мутаций в экзонах гена CDKN1B (характерных для синдрома МЭН-4), что подтверждает данные о незначительном вкладе таких мутаций в развитие фенокопий МЭН-1 [2, 19]. У пациентки №9 была выявлена замена в 3’-UTR гена CDKN1Bg.3897G>T (c.*8G>T)), однако ее патологическая значимость не доказана.

Как уже отмечалось, среди АГ у наших пациентов с фенокопиями МЭН-1 преобладали соматотропиномы, что соответствует данным литературы [2]. Сочетание акромегалии и ПГПТ может объясняться и тем, что при акромегалии возрастает частота новообразований (преимущественно щитовидной железы и желудочно-кишечного тракта) [20]. Не исключено, что и ПГПТ может быть обусловлен длительным действием избытка инсулиноподобного фактора роста 1 на околощитовидные железы. Однако данная теория не объясняет возникновение ПГПТ у пациентов с фенокопиями МЭН-1 в сочетании с другими АГ (пролактиномами, кортикотропиномами и ГНАГ). Также необходимо учитывать, что ПГПТ встречается в общей популяции (преимущественно у женщин в постменопаузе) достаточно часто, тогда как частота АГ значительно меньше, а НЭО ПЖ – крайне редки [5, 21]. Тем не менее возможно случайное сочетание двух новообразований у одного пациента. Возможно также существование других генов (в том числе еще не идентифицированных), мутации в которых могут приводить к сочетанию АГ с ПГПТ и/или с НЭО ПЖ.

Мутации в большинстве известных генов, ассоциированных с формированием наследственных и спорадических АГ, не обусловливают развитие фенокопий синдрома МЭН-1. Необходимость прицельного исследования гена AIP у всех пациентов с фенокопиями этого синдрома требует дальнейшего обоснования. Для исключения патологической роли выявленных изменений в генах PTTG2, PRKAR1А, 3’-UTR CDKN1B необходимы исследования с применением молекулярно-биологических методов. Равно необходим поиск новых генов, мутации в которых могли бы быть причиной формирования фенокопий синдрома МЭН-1.

Благодарности

Мы благодарим врачей отделения нейроэндокринологии и остеопатий ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава Росиии за активное участие и помощь в проведении исследования (Ж.Е. Белая, С.Д. Арапова, Т.С. Зенкова, Е.И. Марова).

Информация о финансировании и конфликте интересов.

Работа выполнена при поддержке гранта Президента Российской Федерации № МК-5411.2014.7 «Молекулярно-генетические основы семейных аденом гипофиза».

Участие авторов: концепция и дизайн исследования — Н.Г. Мокрышева, Л.К. Дзеранова, Е.А. Пигарова, Л.Я. Рожинская, А.Н. Тюльпаков; сбор и обработка материала — Е.О. Мамедова, Е.А. Пигарова, Е.Г. Пржиялковская, Е.В. Васильев, В.М. Петров, Н.Н. Молитвословова, Л.К. Дзеранова, Н.Г. Мокрышева; статистическая обработка данных — Е.О. Мамедова, Е.В. Васильев, В.М. Петров; написание текста — Е.О. Мамедова; редактирование — Н.Г. Мокрышева, Е.А. Пигарова, Е.Г. Пржиялковская, Н.Н. Молитвословова, Л.К. Дзеранова, Л.Я. Рожинская, А.Н. Тюльпаков, Г.А. Мельниченко