ГИП — глюкозозависимый инсулинотропный полипептид

ГПП-1 — глюкагоноподобный пептид-1

ДПП-4 — дипептидилпептидаза-4

ПГТТ — пероральный глюкозотолерантный тест

СД — сахарный диабет

ЭСД — экспериментальный сахарный диабет 

Профилактика и лечение сахарного диабета (СД) остается важнейшей медико-социальной проблемой. Число больных СД к концу 2015 г. достигло 415 млн человек, а к 2040 г. в мире будет насчитываться около 642 млн больных СД [1, 2].

В последние годы противодиабетическая терапия обогатилась новыми лекарственными средствами. Большое внимание привлекают препараты с инкретиноподобным (синтетические аналоги ГПП-1, устойчивые к действию ДПП-4) и инкретинмиметическим (ингибиторы ДПП-4) действием. Стимуляторы выработки собственных инкретинов находятся на разных стадиях клинических испытаний, и многие исследователи усматривают в их использовании весьма перспективный подход к терапии СД [3—5]. Инкретины, помимо стимуляции выработки инсулина, замедляют опорожнение желудка, создавая ощущение сытости, подавляют аппетит и тормозят процессы всасывания в кишечнике, способствуя потере массы тела [3—6]. Это выгодно отличает их от препаратов инсулина, производных сульфонилмочевины, тиазолидиндионов, которые увеличивают массу тела и могут вызывать гипогликемию.

Открытые в последние годы рецепторы (GRP40, GRP41, GRP43, GRP119, GRP120), локализованные преимущественно на клетках кишечника и поджелудочной железы, в физиологических условиях играют важную роль в регуляции секреции инкретинов. Секреция ГПП-1 и чувствительность к нему при сахарном диабете 2-го типа (СД2) снижаются, поэтому повышение его выработки с помощью агонистов указанных рецепторов может стать эффективным подходом к профилактике и терапии СД2 [3—7]. Волгоградскими фармакологами совместно с ЗАО ИИХР «Химрар» синтезировано соединение ZВ-16, обладающее высокой агонистической активностью в отношении рецептора GPR119. Помимо выраженного гипогликемического эффекта, его курсовое введение снижает у животных массу тела и аппетит [8] и улучшает толерантность к глюкозе [8, 9].

Цель настоящего исследования — изучение влияния курсового введения агониста рецептора GPR119 (соединения ZB-16) и ингибитора ДПП-4 (ситаглиптина) на уровень гликемии, выработку инсулина, толерантность к глюкозе и морфологию панкреатических островков при экспериментальном СД2.

Исследование выполнено на 40 крысах-самцах Wistar с массой тела 260—280 г. с соблюдением правил Европейской конвенции по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986), а также в соответствии с Приказом Минздрава и СР РФ №708н от 23.08.10 «Об утверждении правил лабораторной практики» и ГОСТ Р-53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики». Данное исследование было одобрено региональным независимым этическим комитетом ГУ Волгоградского медицинского научного центра (протокол №191-2014 от 25.02.14).

Животные были разделены на четыре группы: 1-я группа — интактные животные, 2-я группа — животные с экспериментальным сахарным диабетом (ЭСД), получавшие внутрь физиологический раствор, 3-я группа — животные с ЭСД, которым вводили внутрь ингибитор ДПП-4 — ситаглиптин (Янувия, «Merck Sharp & Dohme B.V.», Нидерланды) в дозе 10 мг/кг, 4-я группа — животные с ЭСД, которым вводили соединение ZВ-16 в дозе 1 мг/кг.

ЭСД вызывали путем однократного внутрибрюшинного введения стрептозотоцина (65 мг/кг, «Sigma-Aldrich», США) через 15 мин после введения никотинамида (230 мг/кг, «Sigma-Aldrich», США) [10—12]. В эксперимент включали животных с уровнем глюкозы в крови 8—14 ммоль/л; гликемию измеряли после 6-часового голодания на 3-и сутки после введения стрептозотоцина (глюкометр Контур ТС). В дальнейшем крысы с ЭСД в течение 4 нед 1 раз в день получали внутрь физиологический раствор, соединение ZB-16 или ситаглиптин. На 14-й и 28-й день вновь регистрировали гликемию и проводили пероральный глюкозотолерантный тест (ПГТТ) с введением 3 г/кг глюкозы. Рассчитывали площадь под кривой «концентрация глюкозы—время» (AUC) [13]. В конце эксперимента (28-й день) у всех животных в ходе ПГТТ измеряли уровень инсулина до и через 15 мин после введения глюкозы. Уровень инсулина в сыворотке определяли иммуноферментным методом с помощью ИФА-комплекса фирмы «Tecan» (Австрия) и наборов антител к крысиному инсулину (Rat Insulin, (INS) ELISA Kit, 96 CSB). На основании полученных данных рассчитывали индекс HOMA-IR, позволяющий оценить инсулинорезистентность.

По завершении эксперимента крыс умерщвляли (в соответствии с методом, описанным в приказе Минздрава СССР №755 от 12.08.77) и брали ткани для гистологического исследования. Парафиновые срезы толщиной 4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином по общепринятым методикам [14, 15]. Для иммуногистохимического исследования использовали мышиные моноклональные антитела к инсулину (клон 1G4, GeneTex) в разведении 1:100. Для визуализации использовали полимерную систему EnVision (Thermo Scientific, Fremont, CA); хромогендиаминобензидин. Препараты докрашивали гематоксилином и исследовали с помощью микроскопа Axiostar plus («Карл Цейс», Германия); объектив ×10, ×40, окуляр ×10, цифровая камера Canon (Japan, 5.0 мегапикселей). Морфометрическое исследование проводили с помощью компьютерной программы «Видео ТестМорфо-4» (Россия). Определяли периметр панкреатических островков (L, мкм) и их площадь (S, мкм2). Экспрессию инсулина оценивали путем определения абсолютной и относительной площади иммунореактивного материала (β-клеток).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакетов программ: Microsoft Office Excel 2007 («Microsoft», США), Statistica 6,0 («StatSoft, Inc.», США). Для проверки распределения на нормальность использовали критерий Шапиро—Уилка. Далее проводили ранговый однофакторный дисперсионный анализ Краскела—Уоллиса в сочетании с апостериорными критериями Дана (множественные сравнения для выборок разного объема). Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

На 3-и сутки после введения стрептозотоцина формировали три группы животных с примерно одинаковой степенью гипергликемии (табл. 1).

Таблица 1. Уровень глюкозы (ммоль/л) и инсулина (нг/мл) у крыс разных экспериментальных групп

Примечание. * — p<0,05 при сравнении с 1-й группой; # — то же при сравнении со 2-й группой.

Через 14 дней после этого у животных с ЭСД, получавших физиологический раствор, уровень сахара в крови сохранялся на исходном уровне, но к 28-му дню снизился на 18,8%. У крыс, которым вводили ZB-16 или ситаглиптин, содержание глюкозы через 14 дней снизилось соответственно на 18,2 и 9,1%, а через 28 дней — на 36,5 и 38% от исходных значений.

На 14-й день уровень сахара в крови через 30 мин после нагрузки глюкозой у животных 2-й группы (ЭСД без лечения) возрастал на 106%, тогда как у крыс 3-й и 4-й групп (получавших соответственно ситаглиптин и ZB-16) прирост составил 81,6 и 85,5%. Утилизация глюкозы у животных этих двух групп также происходила значимо быстрее, чем у крыс 1-й группы. Через 28 дней ПГТТ показал сходные результаты: меньший прирост гликемии и более быстрая утилизация сахара у животных, получавших ZB-16 и ситаглиптин, чем у крыс с ЭСД, оставленных без лечения.

У животных, не получавших лечения (2-я группа), уровень инсулина через 28 сут был на 22% ниже, чем у интактных крыс (р<0,05). У крыс, которые в течение 28 дней получали ZB-16, уровень инсулина был на 16%, а у тех, кто получал ситаглиптин — на 22% выше, чем у животных 2-й группы. Через 15 мин после введения глюкозы уровень инсулина у крыс 1-й и 4-й групп возрос на 70,6 и 69,7% соответственно, а у животных 2-й и 3-й группы — только на 53,4 и 53,6% соответственно. Индекс инсулинорезистентности у животных, получавших соединение ZB-16 и ситаглиптин, был ниже чем у получавших физиологический раствор (табл. 1).

При патогистологическом исследовании в поджелудочной железе животных 2-й группы отмечалось очаговое полнокровие (рисунок, б, на цв. вклейке). В междольковой соединительной ткани в отдельных случаях наблюдалась очаговая лимфоидная инфильтрация, интерстициальный отек. Панкреатические островки имели неправильную форму, неровные контуры. Их размеры и количество резко уменьшались по сравнению с таковыми у животных интактной группы. Имела место умеренная гипертрофия отдельных эндокриноцитов и их ядер. Средняя площадь панкреатических островков у интактных животных (см. рисунок, а, на цв. вклейке) составила 14600,77±2399,50 мкм2, а их периметр — 495,94±69,93 мкм.

Рис. Островок поджелудочной железы (окраска с антителами к инсулину. Об. ×40).

а — интактные крысы (преобладание инсулин-позитивных β-эндокриноцитов); б — ЭСД (резко выраженное снижение числа инсулин-позитивных β-эндокриноцитов); в — ЭСД + ZB-16 (увеличение количества β-эндокриноцитов по сравнению с группой ЭСД); г — ЭСД + ситаглиптин (увеличение количества β-эндокриноцитов по сравнению с группой ЭСД).

Относительная площадь инсулинпозитивного материала β-эндокрино­цитов составила 61,15±16% (табл. 2).

Таблица 2. Изменение морфометрических параметров панкреатических островков у крыс с экспериментальным СД2

Примечание. *,**,*** — различия с интактной группой достоверны при p<0,05, p<0,01 и p<0,001 соответственно; ##, ### — различия с группой ЭСД достоверны при p<0,01 и p<0,001 соответственно.

У крыс с ЭСД без лечения площадь панкреатических островков снижалась на 66,9% (p<0,001), составляя 4839,36±2753,53 мкм2, а их периметр — на 41,0% (p<0,001). Значимо уменьшилась и относительная площадь инсулин-позитивного материала β-эндокриноцитов (на 43,8%; p<0,001). Сходные результаты получены и другими авторами на моделях стрептозотоцин- и аллоксаниндуцированного ЭСД [10, 11, 14].

У животных с ЭСД, получавших ZВ-16, отмечалось увеличение площади панкреатических островков (см. рисунок, в, на цв. вклейке) и их периметра по сравнению с крысами 2-й группы. Абсолютная и относительная площадь инсулинпозитивного материала β-эндо­кри­ноцитов у этих крыс также была больше, чем у животных 2-й группы, хотя и меньше, чем у интактных крыс. Протективное влияние соединения ZB-16 на островки Лангерганса и β-эндокриноциты крыс с ЭСД было несколько слабее, чем эффект ситаглиптина. Поскольку размеры β-эндокриноцитов были сопоставимы с размерами этих клеток у животных, не получавших лечения, можно полагать, что увеличение площади, занимаемой β-клетками, обусловлено как делением камбиальных (стволовых) клеток с последующей их дифференцировкой, так и уменьшением степени их повреждения и атрофии.

У животных с ЭСД, получавших ситаглиптин (см. рисунок, г, на цв. вклейке), площадь и периметр панкреатических островков также были значимо выше, чем у крыс, не получавших лечения. Абсолютная и относительная площадь инсулинпозитивного материала β-эндокриноцитов у крыс этой группы превышала таковую у животных, оставшихся без лечения. Все это свидетельствует о протективном влиянии ситаглиптина на β-эндокриноциты за счет снижения повреждающего действия гипергликемии и активации механизмов репарации, что характерно для инкретинов [6, 16]. И в данном случае увеличение площади, занимаемой β-клетками, обусловлено, очевидно, ускоренным делением стволовых клеток и уменьшением степени атрофии зрелых клеток.

Средства, влияющие на систему инкретинов, уже прочно заняли свое место в клинической практике лечения СД2. Это ингибиторы ДПП-4 и ГПП-1 в виде их синтетических аналогов, более устойчивых к ферментативному разрушению. Аналоги ГПП-1 (эксенатид, лираглутид, ликсисенатид, альбиглютид, дулаглютид) достаточно эффективны, однако имеют исключительно инъекционный путь введения, что для больных СД2 менее удобно по сравнению с пероральными гипогликемическими препаратами. С открытием ряда рецепторов семейства GPR (GPR40, GPR41, GPR43, GPR119, GPR120), экспрессированных на энтероэндокринных клетках, продуцирующих инкретины (ГИП и ГПП-1), связывают надежды на получение новых эффективных лекарственных препаратов для лечения СД2 и метаболического синдрома. Лидирующие фармацевтические компании («Arena Pharmaceuticals», «GlaxoSmithKline», «Sanofi», «Astellas» и др.) активно ведут поиск агонистов указанных рецепторов. Их отличительными свойствами является связь усиления секреции инкретинов и инсулина в ответ на прием пищи, что важно для эффективного контроля постпрандиальной гипергликемии. В дополнение к этому, следует отметить, что инкретины (ГПП-1 и ГИП) тормозят апоптоз β-клеток поджелудочной железы, стимулируют репарацию и рост панкреатических островков [4, 6, 16, 17]. Полученные в настоящей работе результаты согласуются с данными литературы.

Соединение ZB-16 при курсовом пероральном введении обладает выраженным противодиабетическим действием, которое заключается в снижении уровня гликемии натощак и толерантности к глюкозе при проведении перорального глюкозотолерантного теста, повышении уровня глюкозозависимой секреции инсулина. Это можно объяснить его высокой агонистической активностью в отношении рецептора GPR119, активация которого стимулирует синтез и секрецию инкретинов.

Выявленная в данной работе динамика возрастания относительной площади инсулинпозитивного материала β-эндокриноцитов панкреатических островков, а также площади и периметра островков Лангерганса у животных с ЭСД, получавших ситаглиптин (3-я группа) и соединение ZB-16 в дозе 1 мг/кг (4-я группа), свидетельствует об их протективном влиянии на β-эндокриноциты и, очевидно, об активации механизмов репаративной регенерации β-клеток при индуцированном патоморфозе как минимум за счет уменьшения выраженности повреждения и последующих атрофических изменений, а возможно, и благодаря активации пролиферативной активности камбиальных (стволовых) клеток, что было отмечено в некоторых исследованиях противодиабетических свойств агонистов GPR119 рецептора [5, 7].

Вышеуказанные количественные изменения в ткани поджелудочной железы в совокупности с улучшением ее функциональных показателей (снижение уровня гликемии, улучшение утилизации глюкозы при проведении ПГТТ и повышение как базальной, так и стимулированной выработки инсулина) косвенно свидетельствуют о повышении продукции инкретинов под действием соединения ZB-16, что в совокупности обусловливает перспективность дальнейшего изучения его противодиабетических свойств.

Курсовое введение агониста рецептора GPR119 — соединения ZB-16 животным со стрептозотоцин-никотинамид-индуцированным сахарным диабетом оказывает выраженное противодиабетическое действие, заключающееся в снижении тощаковой гликемии, улучшении утилизации глюкозы, повышении базальной и стимулированной секреции инсулина, а также увеличении площади инсулинпозитивного материала в островках поджелудочной железы. Противодиабетическое действие агониста GPR119 рецептора не уступало таковому у препарата сравнения ситаглиптина.

Информация о финансировании и конфликте интересов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства промышленности и торговли Российской Федерации, в рамках реализации государственного контракта «Доклинические исследования лекарственного средства для лечения сахарного диабета 2 типа на основе агонистов GPR119 рецептора»  № 13411.1008799.154 от 24 июля 2013 г.

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.