аспирант
к.м.н., старший научный сотрудник отделения наследственных эндокринопатий
к.м.н., старший научный сотрудник отделения наследственных эндокринопатий
к.х.н., старший научный сотрудник лаборатории отделения наследственных эндокринопатий
к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории отделения наследственных эндокринопатий
д.м.н., доцент кафедры поликлинической педиатрии и педиатрии ФПК и ПП ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» МЗ РФ; главный внештатный специалист Министерства здравоохранения Свердловской области – детский эндокринолог
сотрудник эндокринологического отделения
сотрудник эндокринологического отделения
д.м.н., заведующий отделением наследственных эндокринопатий
Диагноз MODY должен быть подтвержден молекулярно-генетическим исследованием. В последние годы внедрение технологии секвенирования нового поколения, позволяющей проводить одновременный анализ нескольких генов-кандидатов, значительно упрощает диагностику моногенных заболеваний и, в частности, MODY. Кроме того, одновременный анализ нескольких генов-кандидатов позволяет выявлять случаи с дигенным и олигогенным наследованием. В данной работе мы приводим первое в нашей стране описание случав MODY с дигенным и олигогенным наследованием.
Цель исследования — изучить клинические и молекулярно-генетические характеристики случаев MODY с дигенным и олигогенным наследованием, выявленных по результатам высокопроизводительного параллельного секвенирования.
Материал и методы. В исследование включены 256 пациентов (149 мальчиков, 107 девочек) в возрасте от 3 мес до 25 лет. Критерии включения: нарушения углеводного обмена различной степени, отрицательный титр аутоантител к ICA, GAD, IA2, IAA, сохранная секреция эндогенного инсулина. Молекулярно-генетическое исследование выполнено с помощью высокопроизводительного параллельного секвенирования с применением авторской панели праймеров и полупроводникового секвенатора PGM (Ion Torrent). Все мутации подтверждены методом Сэнгера.
Результаты. У 10 пациентов (8 пробандов, 1 сибс, 1 родитель) выявлен дигенный характер наследования MODY: у 3 пациентов — сочетание мутаций в двух генах-кандидатах MODY, у 7 — в гене-кандидате MODY и другом гене, ассоциированном с сахарным диабетом. В 1 случае (сибс) выявлен олигогенный характер наследования (мутации в генах GCK, HNF4A и INSR). Семь выявленных мутаций ранее описаны не были.
Выводы. Метод высокопроизводительного параллельного секвенирования позволяет активно выявлять случаи дигенного и олигогенного наследования MODY, что крайне важно с позиций возможного влияния сочетанных мутаций на фенотип.
The diagnosis of MODY should be verified by molecular genetic analysis. Recently the introduction of next-generation sequencing, allowing simultaneous analysis of several candidate genes, greatly facilitates the diagnosis of monogenic diseases including MODY. In addition, the simultaneous analysis of several candidate genes allows to identify cases with digenic and oligogenic inheritance. In this work we present the first description of MODY cases with digenic and oligogenic inheritance in our country.
Aim — to characterize MODY cases with digenic and oligogenic inheritance as defined by targeted next-generation sequencing.
Material and methods. 256 subjects (age range, 0.3—25 yrs; males, n=149, females, n=107) were included in the study. The patients fulfilled the following MODY criteria: diabetes or intermediate hyperglycemia, absence of β-cell autoimmunity (ICA, GAD, IA2, IAA antibodies), preserved C-peptide secretion. Molecular genetic analysis was performed by next-generation sequencing using custom Ion Ampliseq gene panel and PGM semiconductor sequencer (Ion Torrent). All mutations were confirmed by Sanger sequencing.
Results. 10 patients (8 probands, 1 sibling and 1 parent) showed digenic inheritance of MODY: 3 patients with combination of mutations in 2 candidate genes of MODY, 7 — in a candidate genes of MODY and another gene, associated with diabetes mellitus. In 1 case (sibling) showed oligogenic inheritance (mutations in GCK, HNF4A and INSR genes). Seven of the identified mutations were not previously described.
Conclusion. Next-generation sequencing is useful in identifying of MODY cases with digenic and oligogenic inheritance, which is extremely important with potentially modifying effect on the phenotype.
Среди моногенных форм сахарного диабета (СД) лидирующее место занимает тип MODY (maturity-onset diabetes of the young, «диабет взрослого типа у молодых»), в основе которого лежат генетические дефекты β-клеток поджелудочной железы (ПЖ). Впервые термин «maturity-onset diabetes of the young» и аббревиатуру «MODY» предложили R. Tattersall и S. Fajans [1, 2] в 1975 г. для обозначения наследственного непрогрессирующего или малопрогрессирующего инсулиннезависимого СД у молодых лиц. MODY характеризуется аутосомно-доминантным наследованием, манифестацией в молодом возрасте (до 25 лет) на фоне отсутствия специфических аутоантител (маркеров разрушения β-клеток) и выраженной вариабельностью клинических проявлений (от непрогрессирующей гипергликемии натощак до тяжелого диабета с сосудистыми осложнениями). К настоящему времени известно 13 генов-кандидатов MODY (HNF4A, GCK, HNF1A, PDX1, HNF1B, NEUROD1, KLF11, CEL, PAX4, INS, BLK, ABCC8, KCNJ11) и, соответственно, 13 его подтипов. «Золотым стандартом» диагностики MODY является молекулярно-генетическое исследование. Ограниченный доступ к молекулярно-генетическим исследованиям, обусловленный длительностью, трудоемкостью и высокой стоимостью метода прямого секвенирования, часто является причиной ошибочной диагностики СД 1-го или 2-го типа у пациентов с MODY и приводит к назначению неадекватной терапии. Кроме того, генетическая верификация диагноза крайне важна для медико-генетического консультирования семьи. В последние годы для установления генетической природы моногенных заболеваний активно применяется технология секвенирования нового поколения, которая позволяет проводить одновременный анализ нескольких генов-кандидатов моногенных заболеваний. К настоящему времени в мире проведено несколько исследований структуры MODY с использованием технологии секвенирования нового поколения [3—7]. Важным преимуществом данного метода перед методом прямого секвенирования является возможность активного выявления случаев дигенного и олигогенного наследования. На сегодняшний момент в литературе имеются описания случаев дигенного наследования MODY, однако они единичные. Случаи олигогенного наследования MODY не описаны. Одно из первых сообщений о дигенном наследовании MODY опубликовано в 2007 г. B.Karges и соавт. [
В нашей стране к настоящему времени опубликован ряд описаний случаев MODY, подтвержденных методом прямого секвенирования [12—17]. Случаи MODY с дигенным или олигогенным наследованием среди них отсутствуют. Нами впервые в отечественной практике применена технология секвенирования нового поколения для генетической диагностики наследственных нарушений углеводного обмена, что позволило впервые выявить случай редкого наследственного варианта СД, обусловленного дефектом гена NEUROD1 (MODY6) [
Цель исследования — изучить клинические и молекулярно-генетические характеристики случаев MODY с дигенным и олигогенным наследованием, выявленных по результатам высокопроизводительного параллельного секвенирования.
Молекулярно-генетическое исследование проведено 256 пациентам (149 мальчиков, 107 девочек) в возрасте от 3 мес до 25 лет. Медиана возраста пациентов на момент исследования составила 11,7 года.
Критерии включения: нарушения углеводного обмена различной степени; отрицательный титр аутоантител к ICA, GAD, IA2, IAA; сохранная секреция эндогенного инсулина. Молекулярно-генетическое исследование проведено с использованием метода высокопроизводительного параллельного секвенирования. Методика подробно описана в работе, посвященной первому описанию в России случая MODY6 [
По результатам молекулярно-генетического исследования у 10 пациентов (8 пробандов, 1 сибс, 1 родитель) выявлено сочетание патогенных или «возможно патогенных» мутаций в двух генах (у 3 — сочетание мутаций в двух генах-кандидатах MODY, у 7 — в гене-кандидате MODY и другом гене, ассоциированном с СД), в 1 случае выявлено олигогенное наследование (мутации в генах GCK, HNF4A и INSR) (табл. 1). В одном из случаев отмечалось сочетание двух мутаций в гене GCK с мутацией в гене INSR. Все мутации найдены в гетерозиготном положении. Среди мутаций выявлена одна дупликация со сдвигом рамки считывания, одна мутация, затрагивающая 5’-нетранслируемую область, одна патогенная cеймсенс-мутация, остальные — миссенс-мутации. Среди выявленных мутаций восемь — новые, а мутации в генах HNF4A, HNF1B и ABCC8 (характерные для MODY1, MODY5 и MODY12, соответственно) впервые описаны в отечественной литературе. Методом прямого секвенирования аналогичные мутации найдены у 7 родителей.
Таблица 1. Случаи MODY с дигенным и олигогенным наследованием
Пациент | Ген | Экзон | Нуклеотидная замена | Аминокислотная замена | Н/О | Ген | Экзон | Нуклеотиднаязамена | Аминокислотная замена | Н/О |
1 | GCK | 7 | c.767A>G | p.E256G | О | HNF1B | 4 | c. 1006C>G | р.H336D | О |
2 | GCK | 3 | c.234C>G | p.D78E | О | WFS1 | 8 | c.1124G>A | p.R375H | О |
3 | GCK | 67 | c.637T>C;c.795G>C | p.C213R;p.E265D | ОН | INSR | 10 | c. 2122G>A | p.E708K | H |
4 | HNF1A | 3 | c.693G>A | p.T231T | О | RFX6 | 18 | c. 2412C>A | p.S804R | Н |
5 | HNF1A | 5 | c.1012dupG | p.G339RfsX80 | Н | INSR | 22 | c. 3919G>A | p.E1307K | О |
6 | HNF1A | 10 | c.1813A>C | p.N605H | Н | GLIS3 | 2 | c. 82A>G | p.I28V | О |
7 | ABCC8 | 10 | c.1531C>G | p.L511V | Н | INSR | 18 | c. 3296C>T | p.T1099M | Н |
8 | GCK | 5 | c.C571T | p.R191W | О | INSR | 10 | c.A2084G | p.Q695R | Н |
9 | GCK | 5 | c.C571T | p.R191W | О | HNF4A | 5’UTR | — | chr.20:43029938_43029944delGGAGGC | О |
10 | GCK | 5 | c.C571T | p.R191W | О | HNF4A | 5’UTR | — | chr.20:43029938_43029944delGGAGGC | О |
11 | GCKINSR | 510 | c.C571Tc.A2084G | p.R191Wp.Q695R | ОH | HNF4A— | 5’UTR— | —— | chr.20:43029938_43029944delGGAGGC— | О- |
Примечание. Пациенты 8—11 из одной семьи П. (8 — пробанд, 9 — сибс, 10 — родитель, 11 — сибс с олигогенным наследованием). Н — новая мутация, О — ранее описанная мутация.
У пациента 2,9 года отмечено сочетание мутаций в двух генах-кандидатах MODY — GCK (MODY2) и HNF1B (MODY5). Подтип MODY5, обусловленный гетерозиготными мутациями в гене HNF1B, в РФ до настоящего времени описан не был. У нашего пациента гипергликемия натощак (6,7 ммоль/л) зафиксирована в возрасте 2,5 года при случайном обследовании. Уровень гликированного гемоглобина (HbA1c) составил 6,0% (норма 4—6%). В течение 4 мес на фоне диеты с ограничением легкоусвояемых углеводов гликемия в течение суток колебалась в пределах 5,3—9,0 ммоль/л. В возрасте 2,9 года в ходе стандартного перорального глюкозотолерантного теста (ОГТТ) выявлена нарушенная толерантность к углеводам на фоне нормоинсулинемии (гликемия натощак — 5,6 ммоль/л, через 2 ч — 10 ммоль/л; базальный инсулин — 2,05 мкМЕ/мл, через 2 ч — 19,78 мкМЕ/мл), а уровень HbA1c составил 6,95%, что позволило подтвердить диагноз СД. Учитывая течение заболевания, отягощенную по нарушениям углеводного обмена наследственность (гестационный СД (ГСД) в анамнезе у матери), пробанду было проведено молекулярно-генетическое исследование и выявлена ранее описанная гетерозиготная миссенс-мутация c.767A>G p.E256G в 7-м экзоне гена GCK, а также ранее описанная гетерозиготная миссенс-мутация c.1006C>G р.H336D в 4-м экзоне гена HNF1B [
Ранее не описанная дупликация со сдвигом рамки считывания p.G339RfsX80 c.1012dupG в 5-м экзоне гена HNF1A и описанная мутация c. 3919G>A p.E1307K в 22-м экзоне гена INSR обнаружены у пробанда 16 лет с отягощенной наследственностью по СД в 4 поколениях. Гипергликемия (6,8 ммоль/л) выявлена случайно при обследовании по поводу ожирения (SDS ИМТ +2,34). При ОГТТ выявлен СД (13,4 ммоль/л на 120 мин), HbA1c — 6,3%, однако специфические аутоантитела обнаружены не были. Заподозрен моногенный характер СД и методом прямого секвенирования проведено молекулярно-генетическое исследование гена HNF1A, но мутаций обнаружено не было. Учитывая наличие ожирения и гипергликемии, назначена терапия метформином в дозе 1000 мг/сут с положительным эффектом (HbA1c на фоне терапии — 5,11%). Через полгода отмечено нарастание уровня HbA1c до 7,2%, гликемия натощак достигала 9,2 ммоль/л, в течение дня — 13,7 ммоль/л, что потребовало увеличения дозы метформина до 2000 мг/сут без видимого эффекта. Пациент повторно направлен на молекулярно-генетическое исследование (панель генов «Сахарный диабет»); использование метода высокопроизводительного параллельного секвенирования позволило установить дигенное наследование СД. Метформин был отменен и с патогенетической целью назначен гликлазид (диабетон МВ 60 мг). На фоне диабетона МВ в дозе 60 мг/сут в течение недели отмечен выраженный положительный эффект (гликемия натощак 4,8—6,6 ммоль/л, в течение дня — до 8,8 ммоль/л). Модификация терапии способствовала не только нормализации гликемии, но и значительному приросту как базального, так и стимулированного уровня инсулина: 5,5—16,5 мкЕ/мл в точках 0 и 120 мин на гликлазиде и 0,9— 4,1 мкЕ/мл в соответствующих точках на фоне метформина.
Уникальный случай сочетания дигенного и олигогенного характера наследования выявлен в семье с большой концентрацией СД (см. рисунок). Поводом для поиска моногенного СД в данной семье послужило выявление нарушений углеводного обмена разной степени у 3 сибсов и отягощенная по СД наследственность по обеим линиям.
Родословная семьи П.
У пробанда в течение 6 лет фиксировалась пограничная гипергликемия натощак (ПГГН), а в 14 лет был диагностирован СД (гликемия натощак до 10,2 ммоль/л, HbA1c до 6,9%), однако в ходе ОГТТ отмечена достаточная секреция инсулина (12,4—33,8 мЕд/л в точках 0 и 120 мин, соответственно). Назначен метформин в дозе 1000 мг/сут, на фоне приема которого в течение последующих 2 лет уровень HbA1c колебался в пределах 6,2—7,7%. Из-за отсутствия стабильного положительного эффекта (последний год HbA1c 7,4—7,6%) рассматривался вопрос о назначении инсулинотерапии. Однако учитывая мягкое течение СД и отягощенную наследственность, пациент был направлен на молекулярно-генетическое исследование, которое обнаружило дигенный характер заболевания: выявлены гетерозиготные мутации в генах GCK (c.C571T p.R191W) и INSR (c.A2084G p.Q695R), последняя — новая. У матери, в анамнезе которой имел место ГСД, проведен поиск данных мутаций методом Сэнгера: найдена только аналогичная мутация в гене GCK. Мутация в гене INSR у пробанда могла быть спорадической, однако отягощенная наследственность по отцовской линии послужила поводом для поиска данной мутации у клинически здорового отца. У него была найдена мутация в гене INSR, что в данном случае свидетельствует о здоровом носительстве. Учитывая полученные данные, был обследован сибс 6 лет, у которого в течение года фиксировалась ПГГН, колебания HbA1c в пределах 6,2—7%. У него была найдена аналогичная мутация в гене GCK. Также был обследован сибс 8 лет, у которого 2 года назад был диагностирован СД 1-го типа, дебютировавший с классических жалоб, но на фоне отсутствия аутоантител. Течение СД у данного пациента потребовало лечения инсулином по интенсифицированной схеме, на фоне чего отмечалась субкомпенсация заболевания (HbA1c 8—8,1%). По результатам секвенирования по Сэнгеру у данного сибса были найдены аналогичные мутации в генах GCK и INSR, однако это не объясняло столь тяжелого течения СД. С целью исключения мутаций в других генах-кандидатах MODY пациенту было проведено исследование панели генов «Сахарный диабет», по результатам которого найдена ранее описанная мутация, затрагивающая 5’UTR в гене HNF4A (MODY1). У остальных членов семьи также был проведен поиск данной мутаций методом прямого секвенирования, и мутация обнаружена у матери и у сибса 6 лет. Таким образом, нам удалось установить дигенное наследование СД у 3 членов семьи и олигогенный характер наследования у 1 из сибсов.
Молекулярно-генетическое исследование, выполненное методом высокопроизводительного параллельного секвенирования, установило факт дигенного наследования MODY у 8 пробандов, 1 сибса и 1 родителя, а также факт олигогенного наследования заболевания у 1 сибса. В ряде случаев проведена модификация терапии, а некоторые пациенты были приглашены для повторного обследования с целью рассмотрения вопроса о модификации терапии. Так, у пациента с установленной мутацией в гене HNF1A (MODY3) метформин был заменен патогенетически обоснованным препаратом из группы сульфонилмочевины, что обеспечило выраженный клинический эффект. Кроме того, у одного из родителей с установленной мутацией в гене GCK была отменена инсулинотерапия, сопровождавшаяся гипогликемиями. Пациент с сочетанной мутацией в гене WFS1 направлен на консультацию оториноларинголога в связи с имеющимися жалобами на снижение слуха. Полученные данные позволили провести медико-генетическое консультирование обследованных семей и дать соответствующие рекомендации. Все пациенты находятся под динамическим наблюдением, что в дальнейшем позволит оценить влияние сочетанных мутаций на фенотип.
На примере семьи П., имеющей столь разнообразные генетические и клинические характеристики, показана значимость правильной диагностики для разработки индивидуальной тактики наблюдения и терапии.
Использование методики высокопроизводительного параллельного секвенирования позволило выявить не только случаи MODY с дигенным и олигогенным наследованием, но и редкие подтипы MODY (MODY1, MODY5 и MODY12, обусловленные мутациями в генах HNF4A, HNF1B и AВCC8, соответственно), ранее не описанные в отечественной литературе. Кроме того, у ряда пациентов мутации в генах MODY сочетались с мутациями в генах INSR, GLIS3 и RFX6, мутации в которых также ранее не описаны в отечественной литературе.
Впервые яркий и разнообразный по своей клинической картине подтип MODY5 был описан в 1997 г. Y.
Впервые в РФ мы выявили пациента с MODY12. Данный подтип обусловлен инактивирующими гетерозиготными мутациями в гене ABCC8, кодирующим SUR1 субъединицу АТФ-зависимых К-каналов. Активирующие же гомо- или гетерозиготные, а также компаунд-гетерозиготные мутации (в данном случае мутантный ген может содержать как активирующую, так и инактивирующую аллели [
На долю MODY1, обусловленного гетерозиготными мутациями в гене ядерного фактора гепатоцитов HNF4A, приходится менее 10% всех случаев MODY. Впервые данный подтип был описан в 1996 г. K. Yamagata и соавт. [
У 5 наших пациентов выявлены мутации в гене INSR, ассоциированные с инсулинорезистентностью. К настоящему времени описано 128 мутаций в этом гене. У наших пациентов трудно охарактеризовать влияние таких мутаций на фенотип, так как они сочетались с мутациями в разных генах-кандидатах MODY.
Следует отметить, что у пациента с сочетанием мутаций в генах HNF1A и RFX6 (на ранних стадиях органогенеза кодируемый геном RFX6 транскрипционный фактор RFX6 участвует в регуляции дифференцировки эндодермальных клеток ПЖ в β-клетки) в дебюте заболевания выявлен кетоз, наличие которого считается нехарактерным для MODY. Однако при первом описании MODY3 в России было установлено, что кетоз в анамнезе не исключает моногенный СД при нетипичной клинической картине [
Описанные нами случаи дигенного и олигогенного наследования MODY требуют дальнейшего наблюдения, что позволит в будущем оценить влияние выявленных генетических дефектов на фенотип.
В последние годы активное внедрение технологии секвенирования нового поколения открыло новые перспективы в диагностике моногенных заболеваний. Методика высокопроизводительного параллельного секвенирования позволяет проводить одновременный анализ нескольких генов-кандидатов MODY без их пошагового исследования методом прямого секвенирования. Важным преимуществом данного метода является возможность активного выявления случаев с дигенным и олигогенным наследованием, что отчетливо продемонстрировано нашим исследованием. Необходимо учитывать, что сочетание мутаций в разных генах может непосредственно отражаться на фенотипе и терапевтической тактике. Кроме того, правильный генетический диагноз служит основой для проведения медико-генетического консультирования семьи. Также необходимо отметить, что данная методика является высокоэффективной в диагностике MODY. Так, у одного из пациентов с подозрением на MODY3 мутации гена HNF1A не были выявлены методом прямого секвенирования. Лишь использование секвенирования нового поколения позволило обнаружить мутацию в этом гене и, кроме того, установить дигенное наследование MODY. Это дало возможность назначить патогенетически обоснованную терапию, что привело к выраженному положительному клиническому эффекту, что крайне важно с учетом возможных сосудистых осложнений при мутациях в гене HNF1A.
Выделяя две стратегии секвенирования генов-кандидатов MODY — последовательное прямое секвенирование генов GCK и HNF1A (как наиболее часто встречающиеся подтипы MODY) и в отсутствие мутаций — панельное секвенирование или первоначальное панельное секвенирование — нужно отметить, что последний метод является экономически оправданным.
Клиническая картина неиммунного диабета зачастую не укладывается в классические критерии MODY, и бывает трудно обозначить ген-кандидат для проведения молекулярно-генетического исследования. Четкая корреляция генотип-фенотип проявляется, пожалуй, только в случае MODY2. Исследования редких подтипов MODY в нашей стране ранее не проводились, а единичные описания в мировой литературе не позволяют в настоящее время установить четкую корреляцию генотип-фенотип для всех подтипов MODY. Методика высокопроизводительного параллельного секвенирования расширяет возможности диагностики редких подтипов MODY и случаев с дигенным и олигогенным наследованием. Приведенное описание случаев MODY с сочетанным наследованием является наиболее крупным среди подобных сообщений и первым в отечественной литературе. Случай же олигогенного наследования MODY описан впервые в мире.
Финансирование исследование. Исследование частично выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект №16-15-10408).
Участие авторов: концепция и дизайн исследования, сбор материала, анализ полученных данных, написание текста: О.А. Гиоева, А.Н. Тюльпаков; сбор материала, анализ полученных данных — Н.А. Зубкова, Ю.В. Тихонович, А.В. Кияев, Л.Г. Черных, О.Ю. Полляк, А.Р. Юсупова; проведение молекулярно-генетического исследования — В.М. Петров, Е.В. Васильев, А.Н. Тюльпаков.
Список сокращений
The authors declare that there are no conflicts of interest present.