Дизайн исследования

Поисковое исследование типа случай—контроль, сплошное, одноцентровое, выполненное одномоментно на выборках больных СД2 и здоровых жителей Республики Башкортостан (см. рисунок).

Дизайн исследования.

Критерии соответствия

Критерии включения в группу пациентов с СД2: возраст 40 лет и старше, диагноз, установленный согласно критериям ВОЗ (1999–2013 гг.), отсутствие клинических признаков других типов сахарного диабета, проживание от момента рождения в Республике Башкортостан, принадлежность к этнической группе татар, отсутствие родства между пациентами, наличие подписанного пациентом информированного согласия на участие в исследовании.

Критерии включения в контрольную группу: возраст 40 лет и старше, отсутствие клинических и лабораторных признаков нарушений углеводного метаболизма, отсутствие наследственной отягощенности по сахарному диабету любого типа, проживание от момента рождения в Республике Башкортостан, принадлежность к этнической группе татар, отсутствие родства между другими участниками исследования, наличие подписанного информированного согласия на участие в исследовании.

Условия проведения

В исследовании приняли участие следующие центры: Клиника Башкирского государственного медицинского университета, Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Республики Башкортостан «Верхнеяркеевская центральная районная больница».

Продолжительность исследования

Период включения в исследование: сентябрь 2015 г. — ноябрь 2017 г.

Описание медицинского вмешательства

У обследуемых лиц проводились сбор демографических данных и анамнеза, анализ амбулаторной карты, антропометрическое обследование, забор 15 мл венозной крови из кубитальной вены однократно натощак в утреннее время.

Основной исход исследования

Определена частота встречаемости аллелей и генотипов полиморфного локуса rs17366743 гена ADIPOQ в группах пациентов с СД2 и условно здоровых лиц.

Дополнительные исходы исследования

У всех пациентов с СД2, включенных в исследование, определяли уровень HbA1c, С-пептида, показатели липидограммы, уровень креатинина крови с расчетом скорости клубочковой фильтрации (СКФ).

Анализ в подгруппах

Для анализа ассоциаций клинико-метаболических показателей с аллелями гена ADIPOQ (rs17366743) группа пациентов с СД2 была подразделена в соответствии с носительством генотипов. В подгруппах произведен анализ ассоциаций аллелей гена ADIPOQ (rs17366743) с возрастом начала, длительностью, частотой хронических осложнений СД2, наличием коморбидной патологии, антропометрическими показателями, показателями липидного и углеводного обмена и функционального состояния почек.

Методы регистрации исходов

ДНК выделяли из венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции. Амплификацию участков ДНК проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на амплификаторе Т-100 Thermal Cycler («Bio-Rad», США), последовательность праймеров приведена в табл. 1. Для идентификации аллелей после амплификации проводили рестрикционный анализ с использованием эндонуклеазы рестрикции RsaI; отсутствие или наличие сайта рестрикции указывает соответственно на носительство аллелей Т или С. В результате рестрикции ампликонов получали фрагменты ДНК размером 148 пар оснований (отсутствие сайта рестрикции) и 75 и 73 пар оснований (наличие сайта рестрикции).

Разделение фрагментов ДНК проводили путем электрофореза в 7% полиакриламидном геле. После окончания электрофореза гели окрашивали раствором бромистого этидия (1%) и визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете с помощью видеогельдокументирующей системы Mega-Bioprint 1100 («Vilber Lourmat», Франция).

Определение уровня общего холестерина (ОХС), триглицеридов (ТГ), холестерина липопротеинов высокой (ЛПВП) и низкой плотности (ЛПНП) проводили методом точечной фотометрии на биохимическом анализаторе Olimpus фирмы «Abbott» (Германия) наборами Beckman Coulter. Определение содержания С-пептида в сыворотке крови проводили методом ферментативно-усиленной хемилюминесценции на автоматическом анализаторе IMMULITE фирмы «DPC» (США) с использованием реактивов фирмы «DPC».

Таблица 1. Последовательности праймеров и размеры аллелей гена ADIPOQ (rs17366743)

СКФ рассчитывали по формуле MDRD (Modification of Diet in Renal Disease Study) (http://mdrd.com/).

Этическая экспертиза

Перед включением в исследование все пациенты подписывали информированное добровольное согласие. Исследование одобрено на заседании экспертного совета по биомедицинской этике по клиническим дисциплинам ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации 15.11.13, комитетом по этике ИБГ УНЦ РАН, протокол №8 от 14.03.12.

Статистический анализ

Размер выборки предварительно не рассчитывался. Статистическая обработка данных проводилась с использованием программ Statistica 6.0 (http://www.statistica.com) и SNPStats (SNPStats: a web tool for the analysis of association studies). Значимость различий между группами по частотам генотипов и аллелей оценивали с использованием двустороннего теста Фишера. Ассоциации считали значимыми при p<0,05. При оценке количественных показателей рассчитывали средние арифметические значения, их стандартные квадратичные отклонения, 95% доверительные интервалы.

Для количественной оценки силы ассоциаций использовали показатель соотношения шансов (OR — odds ratio) и 95% доверительный интервал OR (95% CI — confidence interval). При показателе OR<1,0 генетический маркер считают протективным, при OR>1,0 — предрасполагающим к заболеванию.

Объекты (участники) исследования

Всего был обследован 861 житель Республики Башкортостан. В общую выборку вошли 433 пациента с СД2 (170 мужчин и 263 женщины) и 428 пациентов (140 мужчин и 288 женщин) — контрольная группа. Выборки пациентов и условно здоровых индивидов были сопоставимы по полу, возрасту и этнической принадлежности. Средняя длительность СД2 составила 8,5 года.

Показано, что эмпирическое распределение частот генотипов локуса rs17366743 гена ADIPOQ у здоровых лиц соответствует теоретически ожидаемому равновесию Харди—Вайнберга (χ2=0,53; p=1,00).

Основные результаты исследования

Результаты генотипирования по полиморфному локусу rs17366743 гена ADIPOQ представлены в табл. 2. Обращает на себя внимание высокая частота генотипа CT и аллеля С в когорте пациентов с СД2 по сравнению со здоровыми лицами (15,7% у больных против 6,8% у здоровых; p=0,0001 для генотипов и 7,8% против 3,4%; p=0,0001 для аллелей соответственно).

Таблица 2. Результаты анализа ассоциаций полиморфных вариантов гена ADIPOQ (rs17366743) с СД2

Примечание. n — численность группы, OR — показатель соотношения шансов, 95% CI — 95% доверительный интервал OR; p — вероятность нулевой гипотезы.

Напротив, генотип ТТ (84,3 и 93,2%; p=0,0001) и аллель Т (92,2 и 96,6%; p=0,0001) выявлены среди пациентов с СД2 с меньшей частотой, чем в контрольной группе. Генотип СС не встречался ни в одной из обследованных выборок.

Таким образом, генотип СТ и аллель С локуса rs17366743 гена ADIPOQ являются маркерами риска СД2 с OR=2,56 (p<0,0001) и OR=2,43 (p=0,0002) соответственно.

Дополнительные результаты исследования

Результаты анализа ассоциаций аллелей гена ADIPOQ (rs17366743) с клинико-метаболическими характеристиками пациентов с СД2 представлены в табл. 3.

Таблица 3. Вариабельность значений клинических и метаболических параметров у пациентов с СД2, носителей разных генотипов гена ADIPOQ (rs17366743)

По концентрации базального С-пептида группы пациентов с генотипами ТТ (2,8 нг/мл) и СТ (1,8 нг/мл) значимо различались (p=0,033), что может быть обусловлено функциональной ролью полиморфного локуса rs17366743. Также можно отметить, что средний стаж заболевания у пациентов с генотипом СТ в среднем был больше, чем у пациентов с генотипом ТТ (8,5 и 6,4 года соответственно), хотя это различие не достигало статистической значимости (p=0,094).

Выявлены статистически значимые различия при анализе ассоциаций полиморфных вариантов гена ADIPOQ (rs17366743) с диабетической ретинопатией и катарактой. Установлено, что генотип СТ маркирует повышенный риск развития ретинопатии (p=0,044) и катаракты при СД2 (p=0,008) (см. табл. 3).

По другим показателям углеводного и липидного обмена, частоте встречаемости других осложнений СД2 и по антропометрическим показателям не было обнаружено значимых различий между пациентами с разными генотипами.

Нежелательные явления

В ходе исследования нежелательных явлений зарегистрировано не было.

Резюме основного результата исследования

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о наличии ассоциации полиморфных вариантов локуса rs17366743 гена ADIPOQ с риском развития СД2 среди населения Республики Башкортостан. Присутствие в генотипе «минорного» аллеля С маркирует повышенный риск развития СД2, а также диабетической ретинопатии и катаракты, что согласуется с данными исследования этого локуса среди французов и якутов [17, 18].

Для полиморфного локуса rs17366743 гена ADIPOQ установлена редкая частота встречаемости гетерозигот как в популяции татар (15,7 у больных и 6,8% в контроле), так и в популяциях HapMap, у которых частота гетерозиготного генотипа составила 15%; гомозигот по редкому аллелю С не выявлено ни в одной из групп. В популяции европейцев частота аллеля С составляет около 8% (HapMap-CEU), у индийцев — 2,2%. Частота редкого аллеля, выявленная нами, соответствует встречаемости этого варианта в популяциях Европы. Учитывая редкую частоту встречаемости аллеля С вариабельного локуса rs17366743 гена ADIPOQ, его можно отнести к мутациям.

Обсуждение основного результата исследования

Ген адипонектина ADIPOQ локализован на хромосоме 3 [19]. Этот ген был обнаружен в 1995–1996 гг. при изучении комплементарных ДНК в жировой ткани. Одна из найденных ДНК кодировала специфический коллагеноподобный белок жировой ткани [20]. Продуктом гена ADIPOQ является гормон с молекулярной массой 30 kDa. Показано, что низкая концентрация адипонектина приводит к развитию инсулинорезистентности и СД2 [19]. Адипонектин также усиливает ангиогенез и участвует в регуляции углеводного обмена, приводя к снижению уровня глюкозы (за счет активации АМРК и ингибирования ацетил-КоА-карбоксилазы), обусловливает снижение уровня триглицеридов в крови [21]. Адипонектин увеличивает экспрессию липопротеинлипазы и рецептора ЛПОНП в клетках скелетной мышцы мыши in vivo и культуре миоцитов in vitro. Адипонектин влияет на воспалительные процессы в поврежденных стенках кровеносных сосудов, специфически связываясь в зоне воспаления с клетками, подвергшимися апоптозу, подавляет окислительный стресс и обладает противовоспалительным и антиатерогенным действием [22].

Носительство определенных полиморфных вариантов гена ADIPOQ меняет активность гена и детерминирует развитие ожирения, метаболического синдрома и СД2 [23]. Установлена связь полиморфных вариантов этого гена с инсулинорезистентностью, дислипидемией и атерогенезом [24]. Полиморфный локус rs17366743 гена ADIPOQ является однонуклеотидной заменой T>C в 111-м кодоне экзона 3, в результате чего тирозин меняется на гистамин (Y111H) в аминокислотной последовательности белка. По мнению ряда авторов, такая замена может нарушать структуру и функцию адипонектина. Кроме того, в ряде исследований выявлены ассоциации аллелей этого локуса с уровнем секреции адипонектина, с гипоадиапонектинемией у лиц с нарушенной толерантностью к углеводам [24]. Показана ассоциация аллелей гена ADIPOQ (rs17366743) с СД2, ожирением и нарушением пищевого поведения [13, 25].

В разных этнических группах мира проведены исследования по определению связи полиморфных локусов гена ADIPOQ с СД2, она исследовалась среди французов, шведов, японцев, якутов, киргизов и русских [18, 23, 26–29]. Среди итальянцев, не страдающих сахарным диабетом, полиморфный вариант 276G/T гена ADIPOQ ассоциирован с повышением индекса массы тела и уровня инсулина крови [30].

По данным масштабного исследования [26], проведенного во Франции, частота мутации Y111H T/C (rs17366743) составила 1,5%. Там же была показана функциональная значимость изученного полиморфизма — снижение уровня адипонектина у носителей алллеля С. Предположительно мутация в 111-й позиции препятствует комплексообразованию коллагеновых гомотримеров, что меняет пространственную организацию белка, или влияет на посттрансляционную модификацию. F. Vasseur [17] показал, что полиморфный вариант Y111H 3-го экзона увеличивает риск СД2 в 2,5 раза; ассоциация сохраняется при анализе других гаплотипов, куда входит этот редкий аллель.

Результаты нашего исследования продемонстрировали ассоциацию аллелей гена ADIPOQ (rs17366743) с СД2 среди населения Республики Башкортостан. Как и в европейских популяциях, аллель С является маркером повышенного риска СД2 и его осложнений — диабетической ретинопатии и катаракты. Аналогичные результаты были получены при исследовании данного локуса гена ADIPOQ у якуток с диабетической ретинопатией. Л.Л. Алексеева и соавт. [18] выявили генотип СС в качестве маркера риска. Гомозиготный генотип СС этого локуса выявлен только в популяции якутов. Согласно данным литературы, гомозиготный генотип практически не встречается.

В ряде работ показана связь мутаций гена адипонектина с сердечно-сосудистыми заболеваниями, а также множественными метаболическими нарушениями, которые предрасполагают к прогрессированию СД2. Мутация Y111H T/C (rs17366743) значимо ассоциирована с гипоадипонектинемией [13]. Таким образом, можно сделать вывод о связи этой мутации с различными метаболическими нарушениями [19].

Ограничения исследования

К факторам, ограничивающим значимость результатов и выводов исследования, можно отнести тот факт, что исследование проведено на конкретной выборке из населения Республики Башкортостан. Полученные результаты можно использовать для оценки риска СД2 в других регионах только после их подтверждения в независимо проведенном репликативном исследовании.

Полиморфизм гена ADIPOQ является одной из причин функциональных дефектов либо неадекватной секреции адипокинов, что приводит, в частности, к формированию инсулинорезистентности как одного из ключевых звеньев патогенеза СД2. Ассоциации аллелей гена ADIPOQ с СД2 были исследованы в разных популяциях [9–13]. Спектр аллелей, формирующих наследственную предрасположенность к многофакторным заболеваниям, включая СД2, может варьировать в зависимости от популяционно-генетических особенностей населения разных регионов.

В настоящем исследовании впервые проведен анализ ассоциаций аллелей гена ADIPOQ (rs17366743) с СД2 среди жителей Республики Башкортостан. Показано, что аллель С и генотип СТ предрасполагают к СД2 (OR=2,43 и 2,56 соответственно), обусловливают формирование диабетической ретинопатии и катаракты (p=0,044 и p=0,008 соответственно), а также снижение базального уровня С-пептида (p=0,033).

Таким образом, можно полагать, что полиморфный локус rs17366743 гена ADIPOQ является маркером риска развития СД2 и связанных с ним осложнений у жителей Республики Башкортостан, однако его значимость для диагностики заболевания и тяжести его течения требует дальнейшего изучения.

Источник финансирования. Работа получила частичную финансовую поддержку РФФИ 18-015-00050 и РФФИ 14-06-97003 р_поволжье.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов. Все авторы внесли существенный вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.