Биологические свойства гепоксилинов

Гепоксилины являются продуктами метаболических превращений арахидоновой кислоты, которая чрезвычайно широко представлена в организме, и других, менее распространенных, полностью цисполиненасышенных жирных кислот с 20 углеродными атомами. Они входят в состав клеточных мембран и являются предшественниками целого семейства соединений, названного "эйкозаноиды”, которые служат метаболическими регуляторами и медиаторами различных клеточных функций. Одним из типов эйкозаноидов являются гепоксилины.

Большая часть окислительного метаболизма арахидоновой кислоты в эйкозаноиды осуществляется циклооксигеназными и липоксигеназными ферментными системами. Циклооксигеназа катализирует превращение арахидоновой кислоты в простагландины, простациклины и тромбоксаны. Под влиянием липоксигеназ (LO) идет превращение арахидоновой кислоты в гидроперокси- эйкозатетраеновые кислоты (НРЕТЕ) — короткоживущие метаболиты, которые затем катаболизи- руют в различные типы более стабильных эйкозаноидов (лейкотриены, липоксины и гепоксилины). Гепоксилины образуются под влиянием 12- LO, которая метаболизирует арахидоновую кислоту в 12-НРЕТЕ, а затем в гидроксиэпоксидные метаболиты, получившие название гепоксилинов А₃ и В₃ (рис. 1). Их структурные различия состоят в расположении гидроксильной группы соответственно при 8-м или 10-м атоме углерода и наличии 9, 10-транс-двойной связи в случае гепоксилина А₃ и 8,9-цис-двойной связи в случае гепоксилина В₃. Каждый тип гепоксилинов представлен парой эпимеров, различающихся конфигурацией гидроксильной группы.

Идентификация гепоксилинов как эндогенных биорегуляторов осуществлена в 1982 г. канадским ученым С. Pace-Asciak [14], который до сих пор остается ведущим биохимиком в исследовании гепоксилинов [7].

В 1983 г. американский химик, нобелевский лауреат Е. Corey провел первый полный химический синтез гепоксилинов |6]. В России гепоксилины были синтезированы в Эндокринологическом научном центре РАМН. Здесь разработаны и осуществлены оригинальные методы синтеза гепоксилинов и их метаболитов — триоксилинов [2, 18, 23].

С 1988 г. начались усиленные исследования биологических свойств гепоксилинов. Показано, что они наряду с другими эйкозаноидами образуются во всех органах и тканях, где присутствуют ферменты 12-липоксигеназного пути окисления арахидоновой кислоты, а именно: в тромбоцитах, легочной и мозговой ткани, нейтрофилах, аорте, эпифизе и островках Лангерганса поджелудочной железы |16]. В ряду перечисленных тканей островки Лангерганса занимают особое положение — здесь гепоксилины являются основными метаболитами арахидоновой кислоты.

При изучении биологического влияния гепоксилинов на функцию островков Лангерганса показано, что гепоксилины стимулируют секрецию инсулина, усиливая действие глюкозы [11, 15]. Высокое содержание гепоксилинов в островках

Рис. 2. Влияние 10-эпимеров гепоксилина В₃ на секрецию инсулина культурой островковых клеток (длительность инкубации 30 мин).

По оси ординат — концентрация инсулина в среде (в мкЕД/мл).

Здесь и на рис. 3 и 5: / — гепоксилин I0R-B,; // — гспоксилин IOS-B3. Концентрация гепоксилинов в среде: / — 0; 2 — 0.2 мкМ; 3 — I мкМ; 4—5 мкМ.

Лангерганса и их участие в регуляции секреции инсулина нашло отражение в названии этих соединений. Оно является аббревиатурой фразы ’’Hydroxy Epoxide Insulin Release”. Первая половина этой фразы характеризует химическую структуру соединения, вторая — его функцию. Дальнейшее изучение биологических свойств гепоксилинов позволило выявить, помимо регуляции секреции инсулина, широкий спектр других биологических эффектов этих соединений и показать их участие в регуляции важнейших клеточных функций, таких как контроль проницаемости сосудистой стенки, обмен электролитов, передача нервного импульса и других реакций [17], активность калиевых каналов [10|, освобождение ионов кальция из внутриклеточных депо |8|, обмен диацилг- лицеринов [13] и цАМФ [20].

Мы исследовали прямое влияние гепоксилинов на изолированные клетки, используя для этого первичные культуры островковых клеток поджелудочной железы, культуры клеток аденогипофиза и гепатоцитов крысы. Содержание инсулина, пролактина и альбумина в инкубационной среде определяли радиоиммунологическим методом на основе разработанных в нашей лаборатории гомологичных систем для определения уровня пролактина и альбумина у крыс 11, 3].

В настоящем сообщении приводятся результаты изучения биологических эффектов 10R- и IOS- эпимеров гепоксилина В3. На рис. 2. показано влияние гепоксилинов на секрецию инсулина в культивируемых островках Лангерганса. Оба эпимера гепоксилина В₃ примерно в равной степени стимулируют секрецию инсулина. В случае 10R- эпимера наибольший биологический эффект отмечался при использовании дозы 0,2 мкМ, а в случае 1 OS-эпимера все 3 используемые концентрации препарата давали примерно равный стимулирующий эффект (см. рис. 2).

Поскольку среда, в которой культивировались клетки, содержит глюкозу в концентрации 5,5 мМ, результаты этого эксперимента не позволяют ответить на вопрос, присуще ли инсулинотропное действие самому гепоксилину или оно опосредуется глюкозой, усиливая ее эффект. Чтобы ответить на этот вопрос, мы исследовали действие гепоксилинов на секрецию инсулина при различных концентрациях глюкозы в среде (от 5,5 до 20 мМ), в также в среде, не содержащей глюкозы (рис. 3). Видно, что инсулинстимулирующее действие гепоксилинов было максимальным при концентрации глюкозы 5,5 мМ. С увеличением концентрации глюкозы в среде до 11 мМ стимуляция секреции инсулина гепоксилинами ослабевает и даже исчезает, если содержание глюкозы в среде возрастает до 20 мМ.

Наиболее интересным представляется фрагмент этого эксперимента, где инкубацию островковых клеток с гепоксилинами проводили в растворе, не содержащем глюкозы. При этом на фоне ослабленной секреции инсулина в контроле отмечено выраженное инсулинстимулируюшее действие гепоксилинов, особенно заметное у 10S- эпимера. Секреция инсулина в этом случае на 79—93 % превышала секрецию в контроле.

Из представленных результатов следует вывод, что гепоксилины обладают свойством самостоятельно стимулировать секрецию инсулина, поскольку их эффект может проявляться и в отсутствие глюкозы. В то же время гепоксилины нельзя считать полностью независимыми от глюкозы стимуляторами секреции инсулина, поскольку известно, что глюкоза увеличивает в островках Лангерганса синтез эндогенных гепоксилинов |11, 12]. Исходя из зтого, мы можем предположить 2 механизма участия гепоксилинов в регуляции секреции инсулина: 1) гепоксилины опосредуют инсулинотропное действие глюкозы, являясь его медиаторами; 2) гепоксилины параллельно с глюкозой стимулируют секрецию инсулина, возможно, потенцируя при этом инсулинотропное действие глюкозы. Эти предполагаемые механизмы представлены на рис. 4.

Рис. 3. Влияние гепоксилина В₃ на секрецию инсулина в присутствии и в отсутствие глюкозы в культуральной среде.

По оси ординат — прирост концентрации инсулина (в % к контролю); по оси абсцисс — концентрация глюкозы в среде (в мМ).

Рис. 4. Гипотеза механизма участия гепоксилинов в регуляции секреции инсулина. + — стимулирующий (потенцирующий), — — ингибирующий эффект.

Любой из предложенных механизмов объясняет и наблюдаемое нами снижение эффекта гепоксилинов при увеличении концентрации глюкозы в среде, а также описанное в литературе [12, 22] ингибирование гепоксилинами секреции инсулина при высоких концентрациях глюкозы. Это может быть следствием параллельного росту концентраций глюкозы нарастания количества эндогенных гепоксилинов и стимуляции ими секреции инсулина, достигающей "насыщающих значений" при концентрации глюкозы 20 мМ. На этом фоне системно введенные экзогенные гепоксилины уже не оказывают дополнительного действия на секрецию инсулина, но по механизму отрицательной обратной связи ингибируют биосинтез эндо- генних гепоксилинов, сохраняя неизменным или даже понижая (временно) суммарную концентрацию гепоксилинов с параллельным изменением их биологического эффекта (см. рис. 4).

Другим объектом изучения биологических эффектов гепоксилинов в наших экспериментах были клетки аденогипофиза. В настоящее время сведения о способности клеток гипоталамо-гипофи- зарного комплекса генерировать арахидоновую кислоту и ее липоксигеназные метаболиты в ответ на различные стимулы чрезвычайно скудны. Показано, что арахидоновая кислота и лейкотриены (продукты 5-липоксигеназного пути метаболизма) стимулируют секрецию пролактина в культуре GH₃ клеточной линии аденогипофизарных клеток [9]. Однако в литературе отсутствуют какие-либо данные о влиянии на секрецию пролактина продуктов 12-липоксигеназного метаболизма арахидоновой кислоты. В наших экспериментах (табл. 1) оба эпимера гепоксилина В₃ дали четкий биологический эффект, достоверно ингибируя секрецию пролактина. Результат несколько неожиданный и в настоящее время труднообъяснимый, однако демонстрирующий участие гепоксилинов в регуляции функциональной активности пролак- тинсекретирующих клеток аденогипофиза.

Для изучения влияния гепоксилинов на функцию гормончувствительных клеток периферических органов были выбраны гепатоциты. По данным литературы, 12-LO присутствует в печени |5], а это предполагает наличие в гепатоцитах эндогенных гепоксилинов. С другой стороны, гепатоциты, не являясь элементами эндокринной системы, осуществляют секреторные функции, поставляя в кровоток сывороточный альбумин.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что добавление эпимеров гепоксилина В₃ в среду инкубации гепатоцитов сопровождается изменением их функциональной активности, в результате чего в среде возрастает накопление альбумина (рис. 5, табл. 2).

Таблица I

Влияние эпимеров гепоксилина В, на секрецию пролактина в первичной культуре аденогипофизарных клеток

Примечание. Здесь и в табл. 2 и 3 в скобках — число культур, р дано в сравнении с контролем.

Таблица 2

Влияние эпимеров гепоксилина В₃ (1 мкМ) на продукцию альбумина в культуре гепатоцитов крысы (4 ч культивирования)

Примечание. * — достоверность различий с контролем (р < 0,05).  

Рис. 5. Влияние эпимеров гепоксилина В₃ на продукцию альбумина культурой гепатоцитов (20 ч культивирования).

По оси ординат — концентрация альбумина в среде (в нт/мл • IO^J).

Рис. 6. Секреция инсулина в ответ на глюкозную нагрузку у интактных крыс и крыс с диабетом II типа после 5-дневного введения гепоксилина 10R-B₃ (200 мкг на 1 кг массы тела).

Рассмотренные выше биологические эффекты в отношении секреции инсулина, пролактина и альбумина позволяют сделать заключение о том, что гепоксилины контролируют секреторные про цессы в клетках различной тканевой и органной принадлежности.

В последующих экспериментах мы попытались установить способность гепоксилинов оказывать действие на секрецию инсулина у крыс in vivo. Для этого животным в подключичную вену вводили гепоксилин 10R-B₃ из расчета 50 мкг на 1 кг массы тела. Учитывая скоротечность метаболических превращений гепоксилинов в организме, кровь собирали через 2 и 5 мин после введения препарата (табл. 3). Как свидетельствуют полученные результаты, после введения гепоксилина секреция инсулина у крыс достоверно возрастала. Инсулинстимулирующее действие экзогенного гепоксилина было непродолжительным: уже через 5 мин стимуляция секреции инсулина не достигала статистической значимости.

Таблица 3

Изменение содержания инсулина в крови у крыс под влиянием внутривенного введения экзогенного гепоксилина 10R-B₃ (50 мкг/кг)

По оси ординат — прирост содержания инсулина в крови (в % от исходного уровня); по оси абсцисс — дни после начала введения гепоксилина. / — интактные крысы; 2 — крысы с диабетом II типа.

Дальнейшее изучение биологических свойств гепоксилинов in vivo проводили на крысах с диабетом II типа. Повреждение поджелудочной железы достигалось внутрибрюшинным введением стрептозотоцина (60 мг/кг) крысятам 5-дневного возраста. Через 6—8 нед у животных развивается симптомокомплекс, близкий к клиническим проявлениям инсулиннезависимого сахарного диабета [ 19|.

По нашим данным, у этих животных после введения стрептозотоцина отмечается стойкая гипергликемия, которая держится на протяжении 4 мес наблюдения. Уровень инсулина в крови животных нормальный или даже выше, чем в контроле, однако при этом резко снижается чувствительность инсулярного аппарата к действию глюкозы. Это выявляется при проведении внутривенной глюкозной нагрузки (500 мг/кг), когда становится видно, что р-клетки диабетических крыс практически не реагируют на глюкозу выбросом инсулина в кровь (табл. 4).

На крысах с развившимся диабетом II типа мы проследили особенности действия вводимого в течение 5 дней гепоксилина на уровень гликемии и функцию поджелудочной железы. Условия депонирования экзогенных гепоксилинов достигались подкожным введением гепоксилина 10R-B₃ 2 раза в день в течение 5 дней из расчета 200 мкг на 1 кг массы тела. Изменение показателей гликемии у крыс в этом эксперименте отражено в табл. 5. Здесь же в сравнительном плане представлена группа животных, которым в тех же условиях вводили инсулин "Ультраленте". Как видно из табл. 5, длительное введение гепоксилина оказывает положительное влияние на уровень гликемии у крыс с диабетом, приводя к достоверному уменьшению содержания глюкозы в крови.

Таблица 4

Секреция инсулина в ответ на внутривенную глюкозную нагрузку (500 мг/кг) у интактных крыс с диабетом II тина

Таблица 5

Содержание глюкозы в крови у крыс с экспериментальным диабетом после 5-дневного введения гепоксилина 10R-B₃ (200 мкг/кг) или инсулина “Ультраленте” (5 ЕД/кг)

Заслуживает внимания также тот факт, что после описанного выше длительного подкожного введения гепоксилина островковые клетки, не способные ранее реагировать на глюкозу, частично восстанавливают эту функцию и отвечают выбросом инсулина в кровь (рис. 6). Частичное восстановление чувствительности инсулярного аппарата к глюкозе может быть одним из возможных механизмов наблюдаемого гипогликемического действия гепоксилинов. Последнее может быть связано также с изменением глюкозотолерантно- сти периферических тканей, обычно сниженной при диабете II типа. Такой эффект вполне вероятен, учитывая широкий диапазон мембранных и внутриклеточных эффектов гепоксилинов, однако это предположение требует экспериментального подтверждения. Несомненным остается тот факт, что гепоксилины вовлекаются в регуляцию секреции инсулина при экспериментальной модели сахарного диабета 11 типа. Отсюда следует, что любой дефект, обусловленный нарушением синтеза гепоксилинов, их метаболизма или гормонре- цепторного взаимодействия в островках Лангерганса, может быть одним из патогенетических звеньев развития этого заболевания.

На сегодняшний день большинством исследователей принята концепция, в соответствии с которой метаболиты арахидоновой кислоты—гепоксилины — рассматриваются как вторичные посредники в передаче гормонального импульса или как факторы, взаимодействующие с ним |4, 13]. Поскольку гепоксилины образуются внутриклеточно, а также способны проникать через клеточную мембрану, они, вероятно, опосредуют эффекты многих регуляторных факторов.

Реализация инсулинстимулирующего действия гепоксилинов может обеспечиваться как вне-, так и внутриклеточными механизмами. Наличие рецепторов к гепоксилинам установлено в нейтрофилах человека [21]. На основе этого можно предположить существование рецепторов к гепоксилинам и в островковых клетках. Это позволяет рассматривать гепоксилины как универсальные регуляторы, которые используют единый механизм передачи внеклеточного сигнала для многих типов клеток.

В заключение хотелось бы выделить наиболее перспективные направления дальнейшей работы.

1. Изучение уровней эндогенних гепоксилинов при различных нарушениях секреции инсулина и обмена глюкозы.
2. Создание методов и агентов стимуляции (и ингибиции) синтеза эндогенних гепоксилинов.
3. Исследование влияния гепоксилинов на ткани, резистентные к инсулину, вследствие развития сахарного диабета II типа.