Инсулин рецепторное взаимодействие и ЭПР-спектроскопия при экспериментальном сахарном диабете

Состояние инсулиновых рецепторов (ИР) при экспериментальном сахарном диабете изучено значительно меньше, чем при клиническом сахарном диабете, и полученные результаты не позволяют связать его изменения только с влиянием инсулина. Общепризнанным является тот факт, что при диабете значительно ускоряются процессы перекисного окисления липидов [3], особенно в мембранах и цитоплазме клеток, в частности эритроцитов [1, 2]. В наших предыдущих исследованиях было показано, что в мембранах эритроцитов у беременных с инсулинзависимым сахарным диабетом значительно возрастают процессы перекисного окисления липидов, и это коррелирует со связывающими параметрами ИР [6]. Подобно другим интегральным белкам ИР должен испытывать на себе влияние физико-химических сдвигов в липидном бислое мембраны. Этот вопрос мы исследовали путем определения связывающих параметров ИР эритроцитов, гепатоцитов, скелетных мышц и легочной ткани и структурных свойств плазматических мембран гепатоцитов, эритроцитов и легочной ткани с применением электронного парамагнитного резонанса (ЭПР).

Материалы и методы

Эксперименты ставили на 120 крысах линии Вистар. Диабет вызывали однократным внутрибрюшинным введением 17 мг аллоксана из расчета на 100 г массы животного после 30—48-часового голодания. Крыс брали в опыт через 3, 7 и 14 сут после введения аллоксана с содержанием сахара в крови не ниже 280 мг%. Концентрацию инсулина определяли с помощью радиоиммунных наборов, количество ИР в плазматических мембранах (ПМ) — по ранее описанному методу |5].Связывание ^|2Д-инсулина с рецепторами ПМ клеток исследовали, как описано в работе |9|, с использованием метода вытеснения ^12г>1-инсули- на из комплекса с рецепторами возрастающими количествами немеченого гормона в условиях равновесия 110]. Общее количество инсулинсвя- зывающих мест и сродство рецепторов к гормону определяли по методу [9, 11, 12]. Структурнофункциональные свойства мембран оценивали по результатам измерения микровязкости и гидрофобности мембран клеток методом ЭПР. Использовали метод спинового зонда, позволяющий количественно оценить поверхностный потенциал липидбелковых комплексов [7].Статистическую обработку полученных данных осуществляли с использованием /-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Полученные по усредненным сатурационным кривым насыщения показатели количества и проведенного сродства свободных и занятых ИР (R_o, К_е, соответственно), а также средние величины максимального специфического связывания ¹²⁵1- инсулина в ПМ гепатоцитов свидетельствуют о том, что через 3 сут после введения аллоксана количество ИР достоверно возрастает с 14,3 ± 0,7 до 21,5 ± 2,3 %, через 7 сут — до 24,8 ± 0,9 % по сравнению с контролем (табл. 1). Анализ этих данных по Скэтчарду [12] показал, что количество рецепторов на 3-и сутки составляет 4 и 7 пг/мг белка соответственно для контрольных животных и крыс с диабетом (см. рисунок). Параллельный ход кривых связывания инсулина у подопытных и контрольных животных указывает на то, что сродство гормона к рецептору аналогично у этих групп животных, а различия заключаются в увеличении приблизительно в 2 раза числа ИР на фоне диабета за счет увеличения рецепторной емкости связывания. Введение инсулина нормализовало связывание с рецепторами. Эти данные согласуются с представлением о существовании обратной зависимости между концентрацией инсулина в крови и уровнем его связывания в тканях и о влиянии инсулина на свои собственные рецепторы.

С целью проверки предположения о том, что изменение сродства и количества ИР сопряжено Таблица 1

Показатели инсулинрсцспторного взаимодействия ПМ клеток печени контрольных животных и крыс с диабетом

Примечание. * — различия с контролем достоверны при р < 0,01.

Специфическое связывание ¹²⁵1-инсулина печеночными плазматическими мембранами контрольных (/) и подопытных (2) крыс через 3 сут после введения аллоксана.

а — сатурационные кривые; б — зависимости Скэтчарда. По осям ординат: а — специфически связанный ¹²⁵1-инсулин (в %); о — соотношение связанного и свободного инсулина; по осям абсцисс; а — общая концентрация инсулина (в пМ); б — связанный инсулин (в фмоль/150 мкг белка).

и изменение сродства ИР предшествует изменению их количества, определяли параметры инсу- линрецепторного взаимодействия в ПМ гепатоцитов крыс через 3 и 7 сут после введения аллоксана. При 7-суточном аллоксановом диабете в соответствии с данными других авторов [4, 8] наблюдалось увеличение количества ИР в ПМ печени без изменения их сродства. Через 3 сут после введения аллоксана отмечены аналогичные изменения, т. е. не обнаружено повышения сродства рецепторов, предшествующего увеличению их количества. Степень отрицательной кооперативности рецепторов, характеризуемая соотношением R_f/ К_е, при диабете значительно не изменяется. Максимальное уменьшение этой величины при кратковременном диабете для мембран печеночных клеток было в пределах 30 %.

Таким образом, результаты опытов, проведенных в одних условиях и на одной группе животных, не подтверждают предположения о том, что изменения в сродстве ИР являются первой фазой в изменении их активности, предшествующей изменению количества.

Повышенное связывание инсулина с рецепторами при аллоксановом диабете нами установлено также в ПМ скелетных мышц, причем это наблюдалось при всех исследованных концентрациях гормона по сравнению с контролем (табл. 2.). Анализ данных графика Скэтчарда показал, что увеличение связывания инсулина с рецепторами в исследуемом диапазоне концентрации инсулина обусловлено увеличением количества ИР (р < 0,05). Число рецепторов ПМ составляло 2,8 и 3,3 пг/мг белка для контрольных и подопытных животных соответственно. При этом сродство гормона к рецептору не изменилось.

Преинкубация мембран клеток этих тканей с АТФ подавляла повышенное связывание инсулина с рецепторами и не влияла на этот процесс в контроле. Эти данные могут свидетельствовать в пользу предположения о том, что АТФ оказывает модулирующее влияние на биологическое действие инсулина. То обстоятельство, что АТФ не влияет на связывание инсулина с мембранами здоровых животных, может быть связано с наличием гетерогенных рецепторов в этих тканях, а также с тем, что при диабете происходит более интенсивное фосфорилирование некоторых мембранных белков или групп рецепторов, обусловливающих угнетение связывания гормона с частью рецепторов. Представляет интерес также тот факт, что ингибирование связывания инсулина в мышечной ткани происходило при концентрациях АТФ, которые были значительно ниже физиологических (10~¹² М). В печени эти же концентрации АТФ давали дополнительный угнетающий эффект, хотя максимальное торможение связывания гормона наблюдалось при физиологических концентрациях АТФ (10~³М). Различие концентраций АТФ, подавляющих связывание гормона в печеночной и мышечной тканях, может свидетельствовать также о наличии нескольких АТФ- зависимых ступеней, обусловливающих связывание в этих тканях. Поскольку полагают, что способность рецепторов связывать инсулин регулируется фосфорилированием мембранных белков, возможно, даже самих рецепторов, есть основание допустить, что АТФ может оказывать существенное влияние на процесс связывания инсулина с его рецепторами при состояниях, связанных с резистентностью к инсулину (не только при сахарном диабете).

Инкубирование клеток в среде с оптимальным содержанием глюкозы (10 мМ) и неорганического фосфата (14 мМ) позволило выявить снижение скорости утилизации глюкозы эритроцитами животных после введения аллоксана на 40 % и уровень АТФ на 13 %. Развитие высокой связывающей активности ИР при экспериментальном диабете обусловлено, по-видимому, не только гипо- инсулинемией, вызванной аллоксаном, но и функциональной неполноценностью ИР.

Мы выявили зависимость связывания инсулина от состояния липидов мембран эритроцитов и

Таблица 2

Специфическое связывание ¹²⁵1-инсулина с цитоплазматическими мембранами скелетных мышц

 гепатоцитов. Связывающие характеристики рецептора в первую очередь сопоставляли с такими интегральными показателями структурного свойства липидного матрикса, как его жидкостность и гидрофобность. Установлено, что понижение мембранной жидкостности и гидрофобности гепатоцитов и эритроцитов после введения аллоксана сопровождалось значительным повышением связывания за счет увеличения числа доступных рецепторов. Однако в мембранах легочной ткани крыс большая микровязкость сочеталась с большим числом рецепторов и с более высокой инсулинсвязывающей активностью.

Простые корреляции между уровнем связывания гормона и средней микровязкостью и гидрофобностью мембраны мало что разъясняют в существе липидрецепторных взаимодействий. По- видимому, эти взаимодействия определяются состоянием пограничных липидов (в частности, степенью их переокисления), составляющих непосредственное микроокружение рецепторов. Изменения в липидном матриксе влияют не только на доступность рецепторов для инсулина (т. е. на число рецепторов), но и на их аффинность. Возможно, изменение липидов в микроокружении рецептора влияет на его конформацию и доступность для регуляторных белков (в частности, для инсулина).

Выводы

1. Установлен факт обратной зависимости между концентрацией иммунореактивного инсулина в крови и уровнем его связывания в тканях и влияния инсулина на собственные рецепторы.
2. Существует обратная корреляционная связь между инсулинсвязывающей активностью в клетках и микровязкостью и гидрофильностью в мембранах по данным ЭПР-спектроскопии.
3. АТФ может оказывать существенное влияние на процесс связывания инсулина с его рецепторами при сахарном диабете.