Послеоперационный прогноз при акромегалии: роль иммуногистохимических маркеров

В настоящее время транссфеноидальная аденом- эктомия — метод выбора при лечении акромегалии. Однако в 40—60% случаев удаление аденомы не приводит к полной ремиссии заболевания, что требует дополнительной медикаментозной и лучевой терапии.

Частота ремиссии после хирургического лечения акромегалии зависит от многих факторов. К ним в первую очередь относят размер и характер роста опухоли. Макроаденомы, а также опухоли с экстраселлярным (особенно параселлярным) распространением гораздо сложнее удалить полностью, поэтому эффективность транссфеноидальной аденомэктомии у таких больных значительно снижается [7]. Исход хирургического лечения акромегалии определяется также гормональной активностью аденомы и возрастом пациента [5, 7].

Невысокая эффективность аденомэктомии при акромегалии привела к поиску дополнительных прогностических факторов, которые позволили бы отличать опухоли с высоким риском прогрессии и рецидивирования от менее агрессивных аденом и применять более дифференцированный подход к лечению больных. В качестве таких факторов были предложены белки, продуцируемые опухолевыми клетками, — маркеры опухолевой прогрессии [15].

Для оценки биологического поведения аденом гипофиза у больных акромегалией в данной работе были выбраны наиболее характерные для новообразования свойства: прогрессирование роста, ангиогенез и злокачественный потенциал. Цель работы — с помощью иммуногистохимического метода исследовать маркеры опухолевой прогрессии (Ki- 67, CD31 и галектин-3) в клетках аденом гипофиза у больных акромегалией, перенесших транссфеноидальную аденомэктомию, и изучить связь этих маркеров с факторами неблагоприятного послеоперационного прогноза.

Материалы и методы

Проанализированы истории болезни 39 пациентов с акромегалией (30 женщин и 9 мужчин) в возрасте от 17 до 65 лет, которые после обследования были оперированы и наблюдались в клинике ГУ ЭНЦ РАМН с 1997 по 2004 г. У всех больных была подтверждена активная стадия акромегалии, визуализирована аденома гипофиза и в качестве основного метода лечения проведена транссфеноидальная аденомэктомия. Визуализацию аденом гипофиза проводили с помощью МРТ (у 37 больных) и КТ (у 2 больных), оценивали размер аденомы и ее склонность к инфра-, супра- или параселлярному росту.

У всех пациентов были изучены предоперационные данные: жалобы, анамнестические сведения, результаты офтальмологического обследования, уровень базального СТГ. Кроме того, у 30 больных оценивали результаты подавления СТГ в ходе орального глюкозо-толерантного теста (ОПТ), у 14 больных — уровень ЙРФ-1 (результаты выражались в процентном содержании от половой и возрастной нормы) и у 29 больных — уровень пролактина (ПРЛ) крови.

Транссфеноидальную аденомэктомию проводили трансназальным доступом нейрохирурги ЭНЦ РАМН (К. С. Полещук, Ю. К. Трунин, В. Л. Богданов, А. Н. Шкарубо, В. В. Воскобойников). Операционный материал исследовали с помощью иммуногистохимического окрашивания. Иммуногистохимический анализ проводили стрептавидин- биотин-пероксидазным методом по общепринятой схеме на парафиновых срезах, которые были получены из ткани 39 аденом, удаленных во время операций. Реакцию выполняли с помощью тест-системы OmniTaqs Universal Streptavidin/Biotin Immunoperoxidase Detection System фирмы "Thermo Shandon". Для иммуногистохимического окрашивания использовали моноклональные мышиные антитела фирмы "NOVO CASTRA Laboratories Ltd" к галектину-3 и моноклональные мышиные антитела фирмы "Dakocytomation" к CD31 и к Ki-67 (MIB-1).

Ki-67 — белок с молекулярной массой 360 кД. Ki-67 экспрессируется делящимися клетками во все активные фазы клеточного цикла (Gl, G2 и М), отсутствует в клетках в период покоя (G0) и поэтому считается наиболее специфическим маркером опухолевой пролиферации [17].

CD31, также известный как РЕСАМ-1 (эндотелиальная молекула адгезии тромбоцитов), имеет молекулярную массу 130 кД и относится к классу иммуноглобулинов. CD31 является чувствительным и специфичным антителом к антигенам сосудистой стенки, что позволяет успешно использовать его для определения плотности микрососудов в ткани.

Галектин-3 представляет собой белок с молекулярной массой 31 кД, который связывается с углеводсодержащими компонентами клеток и таким образом обеспечивает их взаимодействие [4]. Га- лектин-3 способствует опухолевой прогрессии: угнетает апоптоз, усиливает ангиогенез новообразования и вызывает его метастазирование [8]. Галектин-3 предложили использовать в качестве маркера злокачественного потенциала, поскольку он выявлялся почти в 100% случаев рака щитовидной железы [10, 19]. Галектин-3 — необлигатный маркер злокачественного опухолевого роста, он может присутствовать в клетках аденом гипофиза, которые, хотя и крайне редко метастазируют, могут вести себя агрессивно: инфильтрировать окружающие ткани и рецидивировать после хирургического удаления.

Для верификации гормонов, секретируемых аденомами, использовали моноклональные кроличьи антитела фирмы "Dakocytomation" к гормонам СТГ и ПРЛ. Гормон роста выявлялся во всех аденомах. В качестве контроля при проведении иммуногистохимической реакции использовали секционный материал гипофиза людей, не имевших нейроэндокринной патологии. Материал получен в 2000 г. из Судебно-медицинского морга № 2 Москвы'.

Анализировали результаты хирургического лечения всех больных. Оценивали уровни базального СТГ и СТГ/ОГГГ, ПРЛ в раннем послеоперационном периоде. Кроме того, были рассмотрены результаты исследования базального СТГ (у 37 больных), СТГ/ОГГГ (у 31 больного), а также ИРФ-1 (у 11 больных) через год после хирургического лечения.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программы Statistica, версия 5.5. При анализе данных оценивали следующие параметры: среднее и стандартное отклонение, или медиану и процентили, для описания количественных признаков (в зависимости от вида их распределения); доли — для описания качественных признаков. При анализе данных сравнивали изучаемые признаки в группах больных с положительной и отрицательной иммуногистохимической реакцией на определяемый маркер. Сравнение групп по количественному признаку проводили с помощью критерия Манна—Уитни, по качественному признаку — с помощью двустороннего критерия Фишера. Различия показателей считали статистически значимыми при р < 0,05. Связь между признаками исследовали с помощью ранговой корреляции Спирмена (5 — коэффициент Спирмена). Корреляцию считали достоверной при р < 0,05.

‘Авторы выражают благодарность судебно-медицинскому эксперту Е. В. Воробьевой за помощь в сборе материала.

Таблица 1. Гормональные показатели до операции

Таблица 3. Частота выявления иммуногистохимических признаков в клетках удаленных соматотропином

Результаты и их обсуждение

Средний возраст 39 обследованных больных в момент операции составил 41,9 ±11,39 года (Л/ ± ст), соотношение женщин и мужчин — 3,3/1 (30 и 9 соответственно). Гормональные показатели и данные МРТ головного мозга до операции представлены в табл. 1 и 2.

При гистологическом исследовании операционного материала в большинстве случаев опухоли гипофиза представляли собой средне- или мелкоклеточные эозинофильные аденомы, реже встречались хромофобные аденомы. В ряде аденом найдены кровоизлияния, кистозный компонент.

Частота выявления маркера пролиферации Ki- 67, маркера ангиогенеза CD31, маркера злокачественного потенциала галектина-3, маркера гормональной активности ПРЛ в клетках удаленных аденом гипофиза представлена в табл. 3. Следует отметить, что Ki-67 был обнаружен только в смешанных СТГ- и ПРЛ-секретирующих опухолях. У 4 из 9 больных со смешанными аденомами отмечалось значительное повышение уровня ПРЛ крови, в то время как у 5 оставшихся пациентов уровень ПРЛ был в пределах нормы.

Длительность наблюдения пациентов после транссфеноидальной аденомэктомии составила 12 мес (медиана) с интерквартильным размахом от 1 до 32 мес. Гормональные показатели больных после операции представлены в табл. 4.

Таблица 2. Данные МРТ до операции

С помощью корреляционного анализа определяли связь между изучаемыми признаками. По данным нашего исследования, чем моложе пациент, тем выше у него предоперационные уровни базального СТГ (5 = -0,55; р = 0,0003), СТГ/ОГТТ (5= -0,38; р = 0,04), ИФР-1 (5= -0,53; р = 0,049) и ПРЛ (У = -0,48; р = 0,009) и больше размер аденомы (5 = -0,37; р = 0,03). Была выявлена связь между размером аденомы (по данным МРТ) и послеоперационным уровнем СТГ. Больший размер опухоли ассоциировался с более высоким уровнем базального СТГ через 1 год наблюдения (5 = 0,62; р = 0,04). Также установлено, что у больных с параселлярным ростом опухоли достоверно реже отмечалась нормализация СТГ/ОГГГ после операции — менее 1 нг/мл (по двустороннему критерию Фишера р < 0,05), чем у пациентов с аденомами непараселлярного характера распространения. Была установлена закономерность: чем выше уровень базального СТГ до операции, тем выше уровень базального СТГ в раннем послеоперационном периоде (У = 0,45; р = 0,009) и уровень базального СТГ и СТГ/ОГТТ через 1 год наблюдения (5=0,59; р = 0,04 и S = 0,81; р = 0,048 соответственно).

При анализе полученных результатов обнаружены различия в группах пациентов с положительной и отрицательной иммуногистохимической реакцией на маркеры опухолевой прогрессии. Так, например, базальный уровень СТГ до операции оказался достоверно выше в группе больных, в клетках аденом которых был выявлен галектин-3 (по критерию Манна—Уитни; р = 0,026), чем в группе пациентов, у которых этот маркер обнаружен не был. Такая же закономерность установлена для маркера ангиогенеза CD31 (по критерию Манна—Уитни; р = 0,022). Кроме того, в группе больных с положительной иммуногистохимической реакцией на CD31 отмечался достоверно более высокий предоперационный уровень СТГ/ОГГГ (по критерию Манна—Уитни; р = 0,028). Выявление Ki-67 и ПРЛ в клетках удаленных аденом ассоциировалось с большим размером опухоли (по критерию Манна—Уитни; р = 0,000038) и наличием параселлярного роста (по двустороннему критерию Фишера; р = 0,026). Хотелось бы также отметить, что ни у одного больного с положительной иммуногистохимической реакцией на Ki-67 и ПРЛ не отмечалось нормализации послеоперационного уровня базального СТГ (менее 2,5 нг/мл). Статистически значимой корреляции между выявлением иммуногистохимических маркеров и другими факторами не найдено.

Таблица .4 Гормональные показатели после операции

Обсуждение

Во многих ранее опубликованных исследованиях было показано, что молодой возраст [7], высокий предоперационный уровень СТГ [5], большой размер [1, 12] и параселлярный характер роста аденомы [7, 11] являются факторами неблагоприятного прогноза при хирургическом лечении акромегалии. В нашей работе все вышеперечисленные факторы сопутствовали повышенному уровню СТГ после операции, что подтверждает их отрицательную роль в исходе транссфеноидальной аденомэкто- мии. Помимо общеизвестных прогностических факторов, мы с помощью иммуногистохимического метода исследовали маркеры биологического поведения опухоли.

Изучение маркера клеточной пролиферации Ki- 67 в опухолях различной локализации подтвердило наличие связи между экспрессией Ki-67 в опухолевой ткани и клиническими проявлениями, прогнозом опухоли. Наиболее ярко это показано на примере рака молочной железы и простаты [3, 22]. Данные, полученные в большинстве работ на опухолях гипофиза, подтверждают, что Ki-67 чаще экспрессируется в аденомах, склонных к инвазии в кавернозный синус [16, 21, 31]. Однако другие авторы не находят различий в содержании Ki-67 в инвазивных и неинвазивных аденомах гипофиза [20], в том числе и в соматотропиномах [2]. Т. Mi- zoue и соавт. [18] установили связь между экспрессией Ki-67 и вероятностью рецидива после удаления аденом гипофиза: доля клеток с положительной иммуногистохимической реакцией на Ki-67 у 3 пациентов с рецидивом аденомы гипофиза после ее удаления оказалась выше, чем у 40 пациентов без рецидива. При оценке описанных в литературе результатов следует учитывать, что в большинстве случаев группа исследованных аденом разнородная и включает как гормонально-активные опухоли (соматотропиномы, кортикотропиномы, пролактиномы), так и гормонально-неактивные новообразования.

В нашей работе Ki-67 достоверно чаще выявлялся в клетках соматотропином с параселлярным характером роста, который свидетельствует об инва- зивности опухолевой ткани. Кроме того, Ki-67 определялся чаще в клетках аденом большого размера. В единственном исследовании, посвященном изучению зависимости экспрессии Ki-67 от размера аденом гипофиза, различий между макро- и микроаденомами найдено не было [16]. Это несоответствие полученным результатам может быть обусловлено тем, что в нашем исследовании микроаденома гипофиза определялась лишь у 2 больных, в то время как макроаденома — у 37 пациентов.

Ни у одного из больных, в клетках аденом которых был выявлен Ki-67, не удалось нормализовать уровень базального СТГ в послеоперационном периоде (менее 2,5 нг/мл).

Таким образом, результаты нашего исследования подтверждают, что выявление маркера клеточной пролиферации Ki-67 в клетках соматотропином связано с наличием таких неблагоприятных факторов послеоперационного прогноза, как большой размер аденомы гипофиза, параселлярный характер роста, отсутствие нормализации базального СТГ после операции. Следует особо отметить, что в нашем исследовании Ki-67 выявлялся только в клетках аденом со смешанной СТГ- и ПРЛ-секре- тирующей активностью. Поэтому все закономерности, полученные для Ki-67, распространяются на смешанные аденомы. Сходные данные были получены в исследовании С. Botelho и соавт. [6], которые изучали экспрессию Ki-67 в трех типах аденом: изолированных соматотропиномах, смешанных СТГ- и ПРЛ-секретирующих опухолях и пролактиномах. Согласно полученным ими данным, Ki-67 не выявлялся в аденомах с изолированной секрецией СТГ, а обнаруживаются только в тех опухолях, которые давали положительную реакцию на ПРЛ, из чего авторы сделали вывод, что Ki-67 не может использоваться как прогностический маркер в соматотропиномах [6]. Связь между экспрессией Ki-67 и ПРЛ остается неясной. Возможно, генетически заложенная способность опухолевой ткани к секреции ПРЛ определяет повышенную пролиферативную активность соматотропиномы и высокую экспрессию Ki-67. Хорошо известно, что смешанные СТГ- и ПРЛ-секретирующие аденомы — более инвазивны и агрессивны и ухудшают исход операции [14]. Необходимо провести дополнительные исследования на аденомах с изолированной секрецией СТГ и ПРЛ для уточнения роли Ki-67 как прогностического маркера. Иммуногистохимическое исследование удаленных аденом у больных акромегалией на наличие ПРЛ может быть рекомендовано в связи с возможным отсутствием клинических проявлений смешанной СТГ- и ПРЛ- секретирующей активности опухоли.

Другой маркер опухолевой прогрессии, исследованный в нашей работе, — CD31 — позволяет судить об опухолевом ангиогенезе. Оценка опухолевого ангиогенеза рассматривается как один из самых успешных маркеров прогноза заболевания, наличия метастазов и чувствительности к лечению. Клиническая значимость определения плотности сосудов в опухоли показана для новообразований различной локализации: чем выше плотность сосудов, тем хуже прогноз для пациента [29, 30]. Интересно, что опухоли гипофиза кровоснабжаются слабее, чем ткань нормального аутопсийного гипофиза [25], в отличие от опухолей любой другой локализации. В ряде исследований было показано, что интенсивность ангиогенеза в пролактиномах зависит от размера опухоли, ее инвазивности и предоперационного уровня гормонов. Плотность сосудов выше в макропролактиномах [27], инвазивных опухолях [26], при высоком предоперационном уровне ПРЛ крови [26]. Однако для соматотропином не установлена зависимость плотности сосудов от размера, инвазивности и предоперационного уровня СТГ [27]. Интересно, что в аденомах с изолированной секрецией СТГ васкуляризация выше, чем в аденомах со смешанной СТГ- и ПРЛ- секретирующей активностью. Существует предположение, что продуцирование опухолью ПРЛ с молекулярной массой 21 кД влияет на синтез ПРЛ с молекулярной массой 16 кД — известного ингибитора ангиогенеза [9]. Исход лечения макропролактином и кортикотропином оказался лучше при низкой васкуляризации аденомы. Однако в случае соматотропином такой закономерности не отмечено [28].

В нашем исследовании также не найдено связи между выявлением CD31 и размером аденомы, параселлярным ростом. Однако установлено, что уровень СТГ до операции достоверно выше в группе пациентов с положительной иммуногистохимической реакцией на CD31. Поскольку высокий предоперационный уровень СТГ является фактором неблагоприятного прогноза при хирургическом лечении акромегалии, маркер ангиогенеза CD31 предположительно также можно использовать в качестве прогностического признака. Необходимо провести дополнительные исследования, чтобы оценить связь этого маркера с отсутствием ремиссии после удаления соматотропиномы, а также установить, является ли он более значимым прогностическим фактором, чем предоперационный уровень СТГ.

Хотя аденомы гипофиза в большинстве случаев — доброкачественные образования, почти у 30% пациентов отмечается инфильтрация окружающих тканей опухолевыми клетками, а у 2—14% возникает рецидив заболевания даже после полного удаления аденомы [13]. Поэтому перспективным считается изучение маркера злокачественного потенциала — галектина-3. Роль этого маркера, как фактора неблагоприятного прогноза, неоднократно показана для опухолей щитовидной железы [10, 19]. К сожалению, на сегодняшний день очень мало известно о присутствии галектина-3 в нейроэндокринных клетках и возможной его роли в прогрессии опухолей из этих клеток. D. Riss и соавт. [23] с помощью метода иммуногистохимической реакции и иммунного блоттинга исследовали экспрессию галектина-3 в 148 удаленных аденомах гипофиза с различной гормональной активностью. Согласно полученным ими данным, галектин-3 выявлялся только в опухолях, секретирующих адренокортикотропный гормон или ПРЛ. В опухолях, продуцирующих гормон роста, тиреотропный или гонадотропные гормоны, галектин-3 не обнаружен. Авторы показали, что в карциномах галектин-3 определялся значительно чаще, чем в аденомах. Кроме того, было доказано участие галектина- 3 в пролиферации и апоптозе клеток аденогипофиза: подавление экспрессии галектина-3 угнетало пролиферацию и стимулировало апоптоз в культуре клеток НР75 [23].

К. Ruebel и соавт. [24] провели исследование, позволяющее объяснить, почему галектин-3 выявляется в аденомах определенного типа и не выявляется в других. Согласно полученным ими результатам, экспрессия галектина-3 в аденомах гипофиза зависит от метилирования промоторного участка гена LGALS3: он выявляется, если этот участок не- метилирован. В неактивных аденомах чаще всего этот участок был метилирован, а в гормональноактивных, таких как пролактиномы и кортикотропиномы, он обычно оказывался неметилирован- ным. Авторы предположили, что выявление галектина-3 в пролактиномах и кортикотропиномах свидетельствует о большей агрессивности и склонности к переходу в карциномы именно этих типов аденом. К сожалению, в соматотропиномах экспрессию галекгина-З авторы не изучали [24]. Несоответствие результатов работы D. Riss нашим данным можно, наверное, объяснить следующим образом: авторы определяли гормональную активность аденом не по клиническим проявлениям, а по результатам окрашивания клеток при взаимодействии с антителами к гипофизарным гормонам. В таком случае к соматотропиномам относились только аденомы с изолированной экспрессией СТГ, в то время как при акромегалии достаточно часто встречаются смешанные аденомы с ПРЛ-секретирующей активностью. Возможно, именно сочетанием ПРЛ/СТГ- продукции в большой доле исследованных нами аденом можно объяснить выявление галектина-3 в 11 случаях, хотя статистически достоверной связи между наличием ПРЛ и галектина-3 в клетках аденом в нашем исследовании найдено не было.

В настоящей работе впервые исследовалась связь между положительной иммуногистохимической реакцией на галектин-3 в соматотропиномах и факторами неблагоприятного послеоперационного прогноза у больных акромегалией. Мы обнаружили, что предоперационный уровень базального СТГ достоверно выше в группе больных с положительной иммуногистохимической реакцией на галектин-3. Поскольку хорошо известно, что высокий уровень СТГ до операции значительно снижает эффективность транссфеноидальной аденомэк- томии, возможно, выявление маркера злокачественного потенциала галектина-3 также является неблагоприятным фактором послеоперационного прогноза при хирургическом лечении акромегалии. Однако, как и в случае маркера CD31, для решения вопроса о применении галектина-3 как прогностического признака необходимы более широкие исследования на соматотропиномах.

Исследование иммуногистохимических маркеров (Ki-67, CD31, галектина-3) в удаленных аденомах может дать дополнительную информацию для установления послеоперационного прогноза у больных акромегалией и своевременного назначения им дополнительной терапии.

Выводы

1. Факторами неблагоприятного прогноза при проведении транссфеноидальной аденомэктомии в нашем исследовании стали молодой возраст, высокий предоперационный уровень базального СТГ, большой размер аденомы и признаки ее параселлярного роста на МРТ.
2. Маркер клеточной пролиферации Ki-67 выявлялся только в аденомах со смешанной СТГ- и ПРЛ-секретирующей активностью. Эти аденомы отличались от изолированных соматотропином большим размером и параселлярным характером распространения. Ни у одного из больных с такими аденомами после операции не был нормализован уровень базального СТГ (менее 2,5 нг/мл).
3. Выявление маркеров злокачественного потенциала галектина-3 и ангиогенеза CD31 было ассоциировано с более высоким уровнем базального СТГ до операции.